Раз плюнуть: что днк-тест может дать человеку?

Сегодня понятие «ДНК-тест» объединяет сразу несколько методов анализа ДНК различной технической сложности и с разными применениями. ДНК-тесты стали повседневностью в судебной практике, активно применяются при планировании беременности и внедряются в во врачебную практику. Узнайте, насколько велики достижения и перспективные применения ДНК-тестов в обычной жизни.

На страже закона

Первые ДНК-тесты появились лишь в 1984, то есть только через 30 лет после определения структуры ДНК. Впоследствии эти тесты стали называть «генетической дактилоскопией» (ГД), поскольку применялись они в основном в судебных процессах.

Как это часто бывает в мире науки, открытие ключевого принципа ГД было почти случайным. Английский учёный Алек Джеффрис изучал минисателлитную ДНК — участки генома, состоящие из десятков повторов длиной 10–50 нт. Он разрезал образцы ДНК с помощью белков-рестриктаз и разделял получившиеся фрагменты по размеру электрофорезом в геле. После нанесения радиоактивных меток на минисателлиты он получал радио-фотографии, на которых были видны отдельные полоски — фрагменты, содержащие искомые повторы различной длины. 10 сентября 1984 при созерцании плёнки с ДНК своего лаборанта и её родителей Джеффрис испытал «чувство эврики»: длина минисателлитов у всех людей разная, но при этом наследуется. Положение полосок родителей было абсолютно разными, но полоски ребёнка обязательно совпадали с полосками одного из родителей [1].

Карьера учёного резко сменила направление. Джеффрис стал исследовать границы применения ГД: можно ли выделить ДНК для анализа из пятна крови, сколько нужно материала, какого точность метода? После ряда публикаций в Nature в 1985 [2] [3]к Джеффрису стали обращаться за помощью. Первое применение ГД в суде — дело о депортации мальчика, чьё родство с матерью-англичанкой не удавалось подтвердить никак иначе. За этим последовал шквал дел, в которых выходцам их Пакистана и Бангладеша удалось доказать своё родство с жителями Объединённого королевства. В результате была оформлена первая компания, специализирующаяся на ДНК-тестах — Сellmark.

Рис.1 — первые судебные ДНК-тесты, основанные на рестрикции полной ДНК и определнии длинн мини-сателлитных последовательностей. (См.текст выше)

В 1986 ГД впервые использовали для поимки преступника. Задержанный полицией Лестера подозреваемый в изнасилованиях и убийствах двух девушек признал свою вину в отношении только одной из жертв. Результат ДНК-теста оказался настолько неожиданным, что сам Джеффрис засомневался в безошибочности метода: сперма с обоих мест преступлений принадлежала одному человеку, но не подозреваемому. В последующие полгода полиция собрала образцы ДНК 5’000 местных мужчин, но преступник так и не был выявлен. Помогла бытовая бдительность: в августе 1987 женщина сообщила полиции о разговоре, слышанном в пабе. Один из местных пекарей говорил, как за 200 фунтов сдал кровь на анализ вместо своего коллеги — Колина Пичфорка (Colin Pitchfork), которого впоследствии и осудили на пожизненное заключение. C тез пор ДНК-тесты стали стандартной процедурой криминалистов [4].

Метод Джеффриса произвёл революцию, но он обладал рядом недостатков. Прежде всего ГД требует микрограммов ДНК, которые можно выделить только из значительного объёма материала. К тому же анализ проводится строго в ручную и может длиться до двух недель. С появлением в 1988 простых в обращении ПЦР-машин, позволяющих амплификацировать отдельные кусочки ДНК, стало ясно, что ГД устарела [1].

Новым и до сих пор актуальным маркером стали более короткие микросателлиты, состоящие из повторов по 3–5 нт. При каждом тесте используется более 10 разных микросателлитов на разных хромосомах. Использование коктейля маркёров увеличивает точность — вероятность случайного совпадения сразу всех маркёров крайне низка, даже если сравнивать ДНК от двух дальних родственников. За счёт замены вырезания амплификацией растёт чувствительность метода — становится достаточно нанограммов материала.

Дальние родственники

Тест на ближайшее родство идейно прост: есть материал от родителя и от ребёнка, или от брата и сестры. А можно ли с помощью ДНК найти дальних родственников? Узнать, из какой страны были твои предки? Оказывается, можно.

Вне судебной практики сегодня обычно проверяют не длину ДНК-повторов, а другой маркёр родства — однонуклеотидные полиморфизмы (SNP, часто встречающиеся у населения различия в одной конкретной позиции генома.

Каждый из нас наследует SNP почти поровну от отца и от матери, и по четверти от своих бабушек и дедушек. Чем древнее предок — тем неуловимей генетический след, поэтому для восстановления генеалогии необходимо проверять как минимум сотни тысяч полиморфизмов.

Наиболее информативны в плане генеалогии Y-хромосома и митохондриальная ДНК. Y-хромосома может достаться сыну только от отца (ХУ), потому что у его матери (ХХ) её просто нет. ДНК митохондрий передаётся только от матери, потому что при оплодотворении митохондрия, содержащаяся в сперматозоиде, уничтожается. С помощью этих участков генома можно определить прямых предков по отцовской и материнской линии, соответственно. Поскольку в них последовательность ДНК меняется особенно медленно, анализ позволяет установить родство людей, чей общий предок жил десятки тысяч лет назад [5].

Рис.2 — Порядок наследования Y-хромосомы и митохондриальной ДНК:
- Y-хромосома передаётся только по мужской линии;
- Митохондриальная ДНК ребёнка всегда сопадает с материнской. Из-за низкой частоты рекомбинации в этих участках генома, они хорошо подходят для установления очень дальнего (до тысяч поколений) родства.

Проверить SNP можно с помощью ДНК-микрочипов. В них на твёрдый носитель нанесено множество SNP-cпецифичных ДНК-проб. Каждая проба комплементарна некоторому участку генома человека, содержащему один из вариантов SNP. Для проведения анализа геномную ДНК человека фрагментируют и каждый кусочек метят флюоресцентным красителем. Далее чип промывают раствором подготовленного образца. При этом комплементарные последовательности на чипе и в образце сливаются в двойную спираль. По флюоресценции красителя детектор определяет, в каких местах чипа произошло слияние, то есть, какие именно SNP присутствуют в образце.

Многие, в основном американские, фирмы предлагают провести генеалогический анализ SNP в ценовом диапазоне $100–300. За эти деньги они высылают клиенту пробирку для сбора слюны, проводят генетический анализ и сравнивают результат со своей базой данных. Из-за сложностей с перевозом биологических жидкостей через границу, зарубежные компании не принимают заказы из России. Но существуют и отечественные компании, предоставляющие аналогичные услуги. Например, фирма «Генотек» за $250 может найти родственников до 15 поколения, а также составить национальный портрет клиента.

Персональная медицина

С развитием геномики стало появляться всё больше научных публикаций, в которых учёные находят связь между SNP и определённым заболеванием или поведением.

Рак возникает при накоплении некоторого числа вредных мутаций в клетках организма. Например, несколько мутаций в генах, ответственных за деление, могут привести к тому, что клетки станут бесконтрольно делиться. Если же человек с рождения обладает некоторыми из них, то у него повышен риск онкологии. Способствующие появлению рака мутации хорошо известны и легко выявляются SNP-генотипированием [6].

Также известны позиции генома, влияющие на накопление лишнего веса [7], формирование вредных привычек [8] и эффективность занятий спортом [9]. Замена одного нуклеотида в одном гене может привести к тому, что например, гормон лептин будет плохо связываться со своим рецептором в мозге, и тогда у человека постоянно будет повышенный аппетит [9].

Генотипирование способно предоставить много полезной информации об оптимальном образе жизни, но эта информация будет полезна только в руках специалиста. 23andme — одна из первых и крупнейших компаний, занимающаяся персональными ДНК-тестами с 2006 года. По предостережению минздрава США она была вынуждена прекратить интерпретацию проводимых тестов, чтобы их клиенты не принимали важные решения без консультации со своим врачом [10]. С тех пор предоставление консультации специалиста по результатам генотипирования стало стандартной практикой в большинстве компаний, проводящих ДНК-тесты: как в зарубежных, так и в отечественных.

Но ДНК-тестирование способно не только прогнозировать и рекомендовать, но и быть единственным способом побороть болезнь. Особенно важно проводить ДНК-тестирование раковых опухолей при химиотерапии. Один и тот же орган могут поразить десятки типов опухолей которые даже будучи внешне похожи могут различаться чувствительностью к медикаментам [11]. Чтобы установить, как подействует лекарство на больного и на рост опухоли, проводят ДНК-тесты [12].

Рис.3 — Лекарство от одной и той же болезни может приводить к совершенно разным результатам в разных людях.
Зная геном пациента, можно предсказать, как его организм отреагирует на альтернативные терапии и выбрать оптимальную. Если такой подход распространится в мировой системе здравоохранения, то фармкомпании перестанут разрабатывать в среднем эффективные препараты и перейдут к парадигме максимальной эффективности для всех групп пациентов.

При менее серьёзных заболеваниях также есть риск прописать лекарство, которое не поможет пациенту с определённым генотипом. Имея доступ к геномным базам данных, фармацевтические компании могут оценить, какая часть населения генетически восприимчива к действующему веществу, а какая — невосприимчива или будет испытывать серьёзные побочные эффекты. В такой ситуации при разработке лекарства логичней всего выбирать такой препарат, который поможет большинству больных. Но что тогда остаётся делать меньшенству? Повсеместное генотипирование может изменить парадигму фармацевтики: лечение заболевания сменится лечением больного. Разработка препарата, направленного лишь на 10% больных, может быть оправдана, если его купит каждый из этих 10%. Если же сегодня выпустить лекарство, сверхэффективное среди 10% астматиков и калечащее остальные 90%, то им, скорее всего, никто не будет пользоваться.

Здоровая семья

Генотипирование семейных пар позволяет предсказать вероятность развития наследственного заболевания у их детей. По данным ВОЗ примерно 1% новорожденных в мире имеют тяжёлые генетические заболеванияя [13], которые являются причиной 20–30% смертей до года [14]. Проводить ДНК-тест будущих родителей необходимо либо при истории наследственных заболеваний в семье, либо же в случае их принадлежности к этнической группе с высоким числом их носителей (Африка — серповидная анемия, Средиземноморье и Юго-Восточная Азия — талассимия, евреи-ашкеназы — болезнь Тея-Сакса). Если риск рождения больного ребёнка высок, то врачи порекомендуют воспользоваться вспомогательными репродуктивными технологиями.

Некоторые болезни особенно сложно предсказать, поскольку для их проявления необходимо сочетание сразу нескольких полиморфизмов в разных генах. Такие полигенные заболевания могут проявиться у ребёнка, даже если в семьях его родителей никогда не было их случаев, но его отец и мать несут отдельные половинки болезни. Если же у родителей часть потенциально опасных мутаций общая, то у ребёнка такое заболевание никогда не возникнет. Поэтому генотипирование нужно проводить только обоим родителям.

Что же дальше?

Генотипирование с помощью ДНК-микрочипов — устаревшая технология. Сегодня в фундаментальной науке микрочипы уже заменены на более точное и производительное полногеномное секвенирование, с помощью которого можно узнать не только отдельные SNP, но каждую букву в генетическом коде человека.

Пока что секвенирование недоступно из-за своей дороговизны. Но цена прочтения одного человеческого генома неуклонно падает: первый геном человека стоил $3 млрд., сегодня — уже $1000 (примерно столько же стоил SNP-анализ 8 лет назад) [15] [16].

Ограничение анализа однобуквенными заменами нуклеотидов — большое упрощение реальной картины. Доступ к целым геномам означает новые возможности персональной медицины: обнаружение ряда более сложных и более точных маркёров, исследования регуляторных областей ДНК, более точные предсказания действий лекарств.

В последнее время становится популярно искать корни болезней в кишечной микрофлоре. Оказывается, между видовым составом микроорганизмов кишечника, представленностью отдельных генов в их совместном метагеноме и здоровьем человека есть прочные связи. Наиболее ярко они выражены при колите и болезни Крона, но часть исселедований также выявила влияние микрофлоры на психологическое состояние. Некоторые фирмы уже предлагают услуги по формированию диеты по данным секвенирования микрофлоры.

Отечественный проект Ohmygut помогает составить рекомендации по питанию на основе метагеномных данных о кишечной микрофлоре.

Пока что сугубо научным остаётся секвенирование отдельных клеток. Благодаря ему, был получен ряд полезных результатов в исследованиях иммунитета, раковых опухолей и развития отдельных органов. С помощью одноклеточного секвенирования станут возможными антираковые терапии, учитывающие гетерогенность опухоли, а также простая и быстрая диагностика плода при искуственном оплодотворении [17].

Также медицина пока не переняла от фундаментальной биологии эпигенетику — науку об информации, хранящейся вне генетического кода. Только после внедрения эпигенетических анализов в системы здравоохранения можно будет смело заявить, что человечество в полной мере освоило персональную медицину. А пока нам остаётся только наблюдать за первыми, но весьма впечатлительными шагами ДНК-тестов на пути к решению загадок человеческого здоровья.

Ссылки

[1]

Jeffreys, A. J. (2013). The man behind the DNA fingerprints: an interview with Professor Sir Alec Jeffreys. Investigative Genetics, 4(1), 21. http://doi.org/10.1186/2041-2223-4-21.

[2]

Gill, P., Jeffreys, A. J., & Werrett, D. J. (n.d.). Forensic application of DNA “fingerprints”. Nature, 318(6046), 577–9. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3840867.

[3]

Jeffreys, A. J., Wilson, V., & Thein, S. L. (n.d.). Individual-specific “fingerprints” of human DNA. Nature, 316(6023), 76–9. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2989708.

[4]

9649 Forensic web watch — DNA in forensic science. (2004). Journal of Clinical Forensic Medicine, 11(5), 271–273. http://doi.org/10.1016/j.jcfm.2004.07.002.

[5]

Colonna, V., Pagani, L., Xue, Y., & Tyler-Smith, C. (2011). A world in a grain of sand: human history from genetic data. Genome Biology, 12(11), 234. http://doi.org/10.1186/gb-2011-12-11-234.

[6]

Müller, B., Wilcke, A., Boulesteix, A.-L., Brauer, J., Passarge, E., Boltze, J., & Kirsten, H. (2016). Improved prediction of complex diseases by common genetic markers: state of the art and further perspectives. Human Genetics, 135(3), 259–72. http://doi.

[7]

Llewellyn, C., & Wardle, J. (2015). Behavioral susceptibility to obesity: Gene-environment interplay in the development of weight. Physiology & Behavior, 152(Pt B), 494–501. http://doi.org/10.1016/j.physbeh.2015.07.006.

[8]

Kakino, K., Kiyohara, C., Horiuchi, T., & Nakanishi, Y. (2016). CYP2E1 rs2031920, COMT rs4680 Polymorphisms, Cigarette Smoking, Alcohol Use and Lung Cancer Risk in a Japanese Population. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention : APJCP, 17(8), 4063–70..

[9]

Leońska-Duniec, A., Ahmetov, I. I., & Zmijewski, P. (2016). Genetic variants influencing effectiveness of exercise training programmes in obesity — an overview of human studies. Biology of Sport, 33(3), 207–14. http://doi.org/10.5604/20831862.1201052.

[10]

Check Hayden, E. (2015). Out of regulatory limbo, 23andMe resumes some health tests and hopes to offer more. Nature. http://doi.org/10.1038/nature.2015.18641.

[11]

Katoh, M., Igarashi, M., Fukuda, H., Nakagama, H., & Katoh, M. (2013). Cancer genetics and genomics of human FOX family genes. Cancer Letters, 328(2), 198–206. http://doi.org/10.1016/j.canlet.2012.09.017.

[12]

Yoo, C., & Park, Y. S. (2015). Companion diagnostics for the targeted therapy of gastric cancer. World Journal of Gastroenterology, 21(39), 10948–55. http://doi.org/10.3748/wjg.v21.i39.10948.

[13]

«Genes and human disease — WHO Genomic resource centre,» [В Интернете]. Available: http://www.who.int/genomics/public/geneticdiseases/en/index2.html.

[14]

Berry, R. J., Buehler, J. W., Strauss, L. T., Hogue, C. J., & Smith, J. C. (1987). Birth weight-specific infant mortality due to congenital anomalies, 1960 and 1980. Public Health Reports (Washington, D.C. : 1974), 102(2), 171–81..

[15]

Check Hayden, E. (2014). Is the $1,000 genome for real? Nature. http://doi.org/10.1038/nature.2014.14530.

[16]

«myGenome — DNA sequencing for health & lifestyle traits,» [В Интернете]. Available: https://www.veritasgenetics.com/mygenome.

[17]

Wang, Y., Navin, N. E., Aceto, N., Bardia, A., Miyamoto, D. T., Donaldson, M. C., … Xie, X. S. (2015). Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell, 58(4), 598–609. http://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.05.005.