Шлях диверсанта: від краплі у повітрі до результатів аналізів (частина третя)
В попередніх двох частинах (перша, друга) я вже розглянув структуру вірусу SARS-CoV-2, витривалість до зберігання на різних поверхнях, специфічність до тканин, проникнення в клітини, залучення імунної системи до цитокінового шторму та інші аспекти. Попри те, що ще багато цікавої та важливої інформації, вирішив наостанок зосередитися лише на двох основних моментах. Вйо до завершення!
Останнім часом відбувся просто вибух “новин” про ураження SARS-CoV-2 клітин крові. Неправильна інтерпретація наукових статей журналістами починає доводити дослідників до сказу…
то що там відбувається насправді?
Перед початком нагадаю, що клітини крові мають спільних попередників. Отже, вибір між виробництвом імунних клітин, тромбоцитів чи еритроцитів дійсно може коштувати організму функціонального стану, сумісного із життям.
еритроцити
Еритроцити, як всі ви напевно пам’ятаєте, є носіями чарівного білка гемоглобіну, який, в свою чергу, відповідальний за транспортування кисню в органи і тканини. Нормальний стан еритроцитів забезпечує їх пластичність для проходження крізь судини із найменшим діаметром та стійкість перед оксидативним стресом в легенях та осмотичним шоком в нирках.
Незважаючи на певну гетерогенність, результати мета-аналізу показують, що значення гемоглобіну істотно знижуються у пацієнтів із тяжкою формою COVID-19 (порівняно з пацієнтами з більш легкими формами) подібно до пацієнтів з іншими типами пневмонії. Відповідно, початкова оцінка та постійний моніторинг значень гемоглобіну є доцільними для пацієнтів із інфекцією SARS-CoV-2. Різке або прогресуюче зниження концентрації гемоглобіну може відображати погіршення клінічного стану.
Але досліджень все ще недостатньо, щоб стверджувати, що трансфузія (пряме переливання крові або еритромаси) допоможе полегшити клінічну картину.
Однак низка ЗМІ (навіть і не просіть цитувати той непотріб), посилаючись на цю саму статтю, вирішили, що якмось чином вірус може уражати гемоглобін та еритроцити. Давайте розберемось не в новині, а по суті.
Еритроцити не несуть необхідного рецептору для зв’язування S-глікопротеїну вірусу (про відповідні клітини та тканини можна почитати ось тут), а також не здатні до ендоцитозу через відсутність необхідних білків та жорсткий цитоскелет, який не дозволить так вигинатися мембрані. Молекула гему міцно (ковалентно) зв’язана із молекулою білка гемоглобіну, який знаходиться всередині еритроциту та аж ніяк не досяжний для вірусу SARS-CoV-2. Залізо, як не дивно, також ковалентно зв’язано із молекулою 1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивініл-6,7-діпропіоновокислого порфіну (пам’ятаю цю скоромовку з 9 класу… бггг…), що разом утворює гем.
так а звідкіля з’явилося твердження про підступний вірус, який вибиває атом заліза з гему?
В одному з пре-принтів (діти, не читайте пре-принтів без належної кваліфікації та уваги до найменших деталей) комп’ютерним моделюванням було “показано”, що білок вірусу взаємодіє із гемоглобіном, а саме з порфірином. Однак, через низьку експертну кваліфікацію науковців, вони використали порфірин без заліза (це також обмеження програмного забезпечення, яке вони використовували — прим. від Семена Єсилєвського), а також не врахували наявність повноцінного йонного оточення (сферичний кінь у вакуумі). В реальних же умовах вірус, скоріше за все, не тільки не матиме можливості так наблизитися до гемоглобіну, але і не зможе з ним взаємодіяти так, як це згадується у тому багатостраждальному пре-принті.
Тобто, на поверхні S-глікопротеїну поки аж ніяк не знайдено рецепторних послідовностей до реального гемоглобіну, а вірус не здатний щось звідкілясь вибивати. Віруси так не працюють, еритроцити так не працюють, гем в шоці, наука схопилася за голову…
тромбоцити
Тромбоцити відповідальні за системи згортання крові, таким чином загоюючи пошкоджені судини. Певний базовий рівень тромбоцитів забезпечує гемостаз, тобто контроль (припинення) кровотечі та збереження крові в межах судин.
Дані ще одного мета-аналізу підтверджують зв’язок низького рівня тромбоцитів із захворюванням на COVID-19. Тромбоцитопенія — це стан, який характеризується наднизькою кількістю тромбоцитів в крові та вважається типовим для важкохворих пацієнтів і, зазвичай, передбачає серйозну органну недостатність або фізіологічну декомпенсацію на відміну від первинної гематологічної етіології. Також часто спостерігається розвиток внутрішньосудинної коагулопатії, що часто розвивається у напрямку поширення внутрішньосудинного згортання крові. У пацієнтів із COVID-19 причини, які впливають на розвиток тромбоцитопенії, ймовірно, багатофакторні. Для пацієнтів із SARS припускалося, що поєднання вірусної інфекції та штучної вентиляції легень (ШВЛ) призводить до пошкодження ендотелію, що викликає активацію тромбоцитів, агрегацію та тромбоз у легенях. Така комбінація факторів призводить до значного споживання тромбоцитів. Більше того, оскільки легені можуть бути місцем вивільнення тромбоцитів із повністю зрілих мегакаріоцитів, зменшення або морфологічне чергування в легеневому капілярному руслі може призвести до уродженої дефрагментації тромбоцитів.
Показано, що низький вміст тромбоцитів пов’язаний із підвищеним ризиком розвитку важкого стану та смертності пацієнтів із COVID-19, тому він цілком може слугувати клінічним показником погіршення перебігу захворювання під час госпіталізації.
лейкоцити як компонент імунної системи
Лейкоцити, залежно від свого типу, залучені до вродженого та набутого імунітету.
Клітини вродженого імунітету не потребують якогось додаткового тренування для виконання своєї роботи. Ці лейкоцити поділяються на нейтрофіли, базофіли, еозинофіли, моноцити та натуральні кілери (один із типів лімфоцитів). Загалом до вродженого імунітету належить низка білків, але наразі не буду зосереджувати на цьому увагу. Вроджені реакції на інфекцію відбуваються швидко та надійно. Навіть немовлята мають відмінні вроджені імунні реакції.
До набутого імунітету належать Т і В лімфоцити, які потребують тренування або навчання з метою не атакувати власні клітини. Перевагою набутого (або адаптивного) імунітету є його тривала пам’ять та здатність адаптуватися до нових патогенів. Ще однією його складовою є антитіла (також відомі як імуноглобуліни, але про них трохи далі) і вони також специфічні по певних патогенів. Новонароджені протягом перших тижнів не виробляють власних антитіл, але, натомість, мають антитіла від матері.
А отже, основне завдання клітин імунної системи — розрізняти клітини нашого організму від патогенів-загарбників, при цьому знешкоджуючи одних і не зачіпляючи інших. Ця особливість імунної системи пояснює, чому наш власний імунітет не може боротися із пухлинними клітинами (як не сумно, але вони наші). Якщо буде цікаво, то про це можу якось згодом написати окремо.
So far so good, першими зазвичай реагують клітини вродженого імунітету, але через неспецифіку такої відповіді її ефективність є низькою. Тому основною метою такої первинної реакції є запуск адаптивної відповіді, що зазвичай займає декілька днів для повної активації.
Низка досліджень та оглядів свідчать про наявність лейкопенії та лімфопенії (зниження кількості відповідних імунних клітин) у випадках з важкими та летальними станами COVID-19.
Ось тут наводиться низка причин для лімфопенії у хворих на COVID-19:
- Вірус безпосередньо вражає лімфоцити через наявний в них рецептор АСЕ2
- Ураження вірусом органів, відповідальних за продукцію цих клітин
- Цитокіни, які продукуються імунними клітинами, можуть уражати самі імунні клітини під час цитокінового шторму
- Інгібування продукції лімфоцитів відбувається через метаболічні продукти, які утворюються при порушенні обміну речовин внаслідок інфекції
Варто зазначити, що згідно з даними, більшість пацієнтів SARS також мали лейкопенію та лімфопенію. Тому цілком логічно, якщо в результаті виявиться, що це є наслідком цитокінового шторму.
Отже, всі клітини крові так чи інакше підлягають вливу у хворих на COVID-19. Як вже зазначалося в другій частині, сам цитокіновий шторм викликає зниження кількості всіх типів клітин крові в кров’яному руслі. Тобто, немає необхідності вірусу впливати безпосередньо на клітини крові для ініціації описаних патологій. Оскільки еритроцити, тромбоцити та лейкоцити мають спільного попередника*, то зниження кількості всіх типів клітин крові одночасно, очевидно, може привести до важких наслідків.
Але все це абсолютно НЕ значить, що вірус не уражає легені, а цілеспрямовано та нещадно вбиває лише клітини крові.
*на прекрасному каналі Цікава наука є чудове відео про спільне походження клітин крові.
і, нарешті, про детекцію SARS-CoV-2 (та інших патогенів)
Цей розділ — це те, заради чого загалом починався весь цей спектакль у трьох діях. Але, перед тим як почати, ще трохи про антитіла.
антитіла, або імуноглобуліни
За продукцію антитіл відовідальні вищезгадані В-лімфоцити (або просто В-клітини). Антитіла, або імуноглобуліни, це великі протеїни Y-форми, які імунна система використовує для ідентифікації та нейтралізації чужорідних об’єктів. Існує 5 основних типів антитіл IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. У кожного з них є своя функція та роль у забезпеченні захисту організму. До прикладу, IgE зв’язується із алергенами та провокує вивільнення гістаміну з подальшими алергічними реакціями (привіт всім, хто страждає від алергії. Тепер ви знаєте кого звинувачувати).
Але наразі нас цікавлять імуноглобуліни М та G, оскільки саме ці антитіла до специфічних патогенів використовуються у якості діагностичного маркеру. Як тільки В-лімфоцит отримує можливість “заковтнути” антиген та “підібрати” відповідну послідовність для його зв’язування, вони стають спроможними продукувати антитіла. Спочатку у відповідь на взаємодію із патогеном, В-клітини продукують спеціальний рецептор — мембрано-зв’язану форму антитіла. Варто зазначити, що всі такі рецептори здатні зв’язуватися лише з одним антигеном (по суті, самим патогеном) за принципом “ключ-замок”. Подальші каскади взаємодій компонентів імунної системи призводять до диференціації В-лімфоцитів в плазматичні клітини, які здатні продукувати “вільні” антитіла.
На самому початку В-лімфоцити продукують IgM і вже потім, під дією цитокінів, інших сигнальних молекул та Т-лімфоцитів, переключаються на продукцію IgG. Під час такого переключення класів антитіл консервативна ділянка важкого ланцюга імуноглобуліну змінюється на відміну від варіабельних. Отже, антигенна специфічність залишається однаковою.
Що виходить в результаті? Кілька днів потрібно для того, щоб активувати В-клітини на продукцію IgM, після чого ще кілька днів, допоки не почнеться продукція IgG, який зберігаме свою присутність в крові від декількох місяців до декількох років і десятків років.
А як тоді це детектувати?
Антитіла в тест-системах також детектуються за принципом “ключ-замок”. Науковці навчилися продукувати антитіла майже до будь-чого. Таким чином, використовуються специфічні антитіла проти IgM та IgG до патогену (в нашому випадку, SARS-CoV-2), які нанесені на поверхню спеціального пластику. Зразок крові пацієнта наноситься зверху цих штучних антитіл і з ними специфічно зв’язуються відповідні IgM або IgG. Наявність цих антитіл далі детектується за допомогою визначення концентрації білка в пробі або міченням ще одними антитілами з барвником (саме тому це метод ще назвається сендвіч).
Оскільки IgM та IgG виявляються через різний час після інфікування, то співвідношення їх вмісту свідчитиме про різні етапи перебігу хвороби. Наприклад, наявність IgM та відсутність IgG свідчитиме про про активну фазу хвороби, а якщо навпаки, то це є ознакою одужання (чи того, що хвороба колись давно була).
Стоп, а як бути із тим, що антитіла з’являються лише на 5–8 день з моменту інфікування?
Звичайно, що антитіла — це лише реакція нашого організму на сам патоген. Ця реакція вимагає часу. Найбільш чутливим методом виявлення самого патогену є … виявлення самого патогену! А саме, його генетичного матеріалу.
Насправді, тест на нуклеїнову кислоту — це не тільки полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, polymerase chain reaction — PCR), але також ампліфікація ДНК з витісненням ланцюга, що синтезується (strand displacement assay — SDA), ампліфікація опосередкована транскрипцією (transcription-mediated amplification — TMA) та інші. Однак, щоб не перевантажувати нюансами і так перевантажений нюансами текст, зупинюся на ПЛР.
Полімеразна ланцюгова реакція дозволяє багатократно примножити кількість фрагментів молекули ДНК в пробі за участі специфічних до її послідовності “затравок”-праймерів (олігонуклеотидів) та ферменту ДНК-залежної-ДНК-полімерази. Для цього спочатку визначаються специфічні для SARS-CoV-2 фрагменти… СТОП 0_0
І тут може в когось з’явитися запитання: а як-то бути, якщо у віруса лише РНК, а написано, що має бути ДНК?
Саме так, мої чарівні уважні читачі. У SARS-CoV-2 геном представлений молекулою РНК. Тому перед постановкою ПЛР, за участю зворотньої транскриптази (до речі, процес зворотньої транскрипції вперше був відкритий Академіком С.М. Гершензоном нашого київського ІМБГ НАНУ, але, через закритість радянської науки, Нобелівська премія дісталася іншим науковцям…) з РНК вірусу синтезується кДНК (комплементарна ДНК). Саме кДНК і є тим матеріалом, що буде використаний для реакції із ДНК-залежною-ДНК-полімеразою (“а тепер слайди” (с), в сенсі, схема нижче).
Продукт можна реєструвати за допомогою забарвлення етидієм бромідом (чи чимось подібним) вже отриманої ДНК. Або, як у випадку з ПЛР в реальному часі, використовуються попередньо мічені компоненти реакції, які дозволяють кількісно чи якісно бачити наявність конкретної послідновності в пробі.
а що там із розподілом подій у часі та чутливістю?
При інфікуванні вірусом (чи іншим патогеном), як не дивно, його генетичний матеріал виявляється вже з перших днів. Іншими словами, можна зареєструвати наявність SARS-CoV-2 в організмі ще задовго до появи симптомів. В першу чергу це стосується епітеліальних клітин носа та гортані (верхні дихальні шляхи).
Як зазначається в посібнику з профілактики та лікування хворих на COVID-19 від першої афілійованої лікарні, медичної школи університету Чжецзян (FAHZU):
Комбіноване виявлення нуклеїнових кислот у різних видах зразків може підвищити точність діагностування. Серед пацієнтів з підтвердженою наявністю нуклеїнової кислоти в дихальних шляхах: у близько 30% — 40% виявлено вірусну нуклеїнову кислоту в крові, а у близько 50% -60% пацієнтів — у калі. Однак позитивний відсоток тестувань на нуклеїнову кислоту у зразках сечі — досить низький. Комбіноване тестування зі зразками з дихальних шляхів, калу, крові та іншими видами зразків є корисним для покращення діагностичної чутливості підозрюваних випадків, контролю ефективності лікування та управління заходами ізоляції після виписки.
Оскільки імуноглобуліни М та G продукуються вже після початку імунної відповіді організму, то не слід очікувати IgM раніше 5–8 дня, а IgG раніше 8–12 дня після інфікування.
А тепер неочікуваний факт: всі ці показники змінюються з перебігом хвороби. Тобто, при появі відчутних симптомів (приблизно 3–5 день з моменту захворювання) рівень РНК вірусу в нашому організмі має бути максимальним та знижуватися зі зменшенням симптомів.
В свою чергу, як вже зазначалося вище, IgM досягає максимуму концентрації раніше за IgG, але пізніше за РНК вірусу.
Коментар із вищезгаданого посібника навздогін:
Позитивний титр сироватково-специфічного IgM або специфічного lgG у фазі одужання (recovery phase) може бути в 4 рази вищим, ніж у гострій фазі (acute phase). Він може використовуватися як діагностичний критерій для пацієнтів з підозрою на інфікування, у яких тест на виявлення нуклеїнової кислоти був негативним. Під час подальшого моніторингу IgM виявляється упродовж 10 днів після появи симптомів, а IgG виявляється через 12 днів після появи симптомів. З підвищенням рівня антитіл у сироватці крові вірусне навантаження поступово зменшується.
Тобто, покращення™ настає тоді, коли реєструються антитіла і низький рівень РНК вірусу, а повноцінне одужання — коли в крові виявляється лише IgG, але не виявляються IgM та РНК вірусу.
те саме джерело:
… пацієнт має продемонструвати негативний результат тесту протягом щонайменше двох послідовних аналізів на нуклеїнову кислоту з інтервалом часу, що перевищує 24 години. Враховуючи зростаючу кількість випадків тестування на COVID-19, що змінюється від негативного до позитивного після лікування, рекомендується переглянути стандарт до трьох послідовних негативних результатів. В ідеалі негативні результати слід спостерігати у всіх пробах рідини в організмі, включаючи кров, мокротиння, зразки із носоглотки, бронхо-альвеолярний лаваж, сечу та кал. Враховуючи складність в роботі, принаймні результат тестування проб мокротиння та бронхо-альвеолярного лаважу повинен бути негативним.
Парадокс всієї цієї ситуації в тому, що бувають хибнопозитивні та хибнонегативні результати. Враховуючи, що наразі немає специфічного лікування хворих на COVID-19, то хибнопозитивний результат не закінчиться чимось серйознішим за самоізоляцію (добре, що немає профілактичного підключення до ЕКМО чи ШВЛ).
Однак, хибнонегативний результат якраз може нести загрозу. Саме тому радять робити обидва тести, на антитіла та ПЛР, щоб максимально унеможливити варіант помилки.
Але краще за все просто запобігати захворюванню:
мити руки, не торкатися зайвий раз писка, носити маску в публічних місцях, прибиратися вдома та не нести зайвого в хату і, звичайно, максимально обмежити офлайн контакти з іншими.
Прості речі рятують життя!
Щиро сподіваюся, що ці статті були комусь корисними та допомогли розібратися з деякими питаннями.
Дуже дякую за приділений час!
якщо раптом не бачили:
в першій частині описав структуру вірусу, витривалість на різних поверхнях, вибір тканин для взаємодії з рецепторами.
в другій частині описав залучення різних білків вірусу SARS-CoV-2 до проникнення в клітини, злиття мембран вірусу та клітини, як реакція імунної системи призводить до цитокінового шторму.
