Yeni koronavirüs — Test Yöntemleri
RT-PCR ve serolojik testler
Bu yazıda yeni koronavirüs tanısı koyabilmek için en sık kullanılan ve temel yöntem olan RT-PCR ve son zamanlarda sıkça duyduğumuz serolojik testler hakkında bilgi vermeye ve bu konudaki 3 makaleyi özetlemeye çalışacağım.
Çalışmaların daha iyi anlaşılabilmesi için kısa bir ön bilgi vermek istiyorum.
Virüslerde genetik materyal olarak DNA veya RNA bulunabiliyor. Yeni koronavirüs de dahil, akciğer enfeksiyonu yapan virüslerin çoğu RNA virüsü. Bu nedenle bu virüslerin, özellikle de yeni tanımlanmış virüslerin tanısı için en çok kullanılan yöntem RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction). RT-PCR yöntemi, önce RNA’dan DNA üretimi, sonra da bu DNA’dan istenen özel bir bölgenin PCR ile milyonlarca kopyasının çoğaltılması prensibine dayanıyor. Çoğaltılan DNA, floresan ölçümü gibi yöntemlerle saptanabiliyor. Bu şekilde, hastadan alınan örnekte virüs RNA’sı olması durumunda çoğalma oluyor, virüs RNA’sı yoksa çoğalma, dolayısıyla sinyal olmuyor. Çoğalmanın başlaması için, kontrol edilmek istenen bölgenin başına ve sonuna bağlanabilen “primer” denilen küçük DNA parçaları kullanılıyor. Bu primerler o bölgeye özel tasarlandığı için, yalnızca bu bölgenin varlığında reaksiyon başlıyor ve çoğalma gerçekleşiyor. Çoğu RT-PCR deneyinde bir de çoğaltılmak istenen bölgenin ortalarında spesifik bir yere bağlanması için tasarlanmış “prob” denilen belirteçler kullanılır. Bu problar floresan moleküller ile işaretlenmiş küçük DNA parçaları olup, çoğalma olursa sinyal verirler. Detaylı PCR ve RT-PCR animasyonları için:
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA
Diğer taraftan serolojik testler, hastadan alınan kan serumunda çeşitli antijenlerin (hastalığa neden olan patojenlere ait proteinler) ve/veya antikorların (antijenlere bağlanıp bağışıklık sistemini aktifleştiren proteinler) varlığının analiz edildiği testlerdir. Bunun için en sık kullanılan yöntem ELISA’dır (enzyme-linked immunosorbent assay). ELISA yöntemi antikor-antijen bağlanması gerçekleştiğinde, enzimatik reaksiyon sonucu renk değişimi gözlenmesi prensibine dayanır. İki temel çeşidi vardır: Birincisinde, bilinen antijenler kullanılarak, test edilecek örnekte bu antijene bağlanabilen antikorlar olup olmadığı belirlenir. İkincisinde ise tam tersi, bilinen antikorlar kullanılarak, test edilecek örnekte bu antikorların bağlanabildiği antijenler olup olmadığı belirlenir. Anlatacağım son makalede, araştırmacılar birinci yöntemi kullanıyorlar.
Bunların dışında çok hassas yöntemlerle virüs RNA’sının direkt (PCR ile çoğaltmaya gerek duyulmadan) algılanmasını sağlayan yeni yöntemler de geliştirilmekte. Fakat çok uzatmamak adına bunlara bu yazıda değinmeyeceğim, belki bir sonraki yazıda…
1- Corman et al., 2020:
Bu makale, yeni koronavirüsün (2019-nCoV) saptanabilmesi için güvenilir bir tanı protokolünün geliştirilip detaylarıyla anlatıldığı ilk çalışmalardan biri.
Her deneyde olduğu gibi, RT-PCR yaparken de yapılan testin doğruluğunu ölçebilmek ve uygulanacak protokolü optimize etmek (en doğru koşulları bulmak) için negatif ve pozitif kontroller kullanılır. Aranan bölgeyi içermediği kesin olarak bilinen örnekler negatif kontrol olarak kullanılır. Pozitif kontrol ise aranan bölgeyi içerdiği kesin olarak bilinen örneklerdir. Bu yüzden, test düzgün çalışıyorsa negatif kontrolde kesinlikle çoğalma görülmemeli, pozitif kontrolde ise kesinlikle çoğalma görülmelidir. Ancak bu koşullarda test edilmek istenen örneğin sonucuna güvenilebilir.
Araştırmacılar, klasik enfeksiyon tanı testlerinde, o enfeksiyona yol açan virüslerin eski vakalardan toplanmış stoklarının pozitif kontrol olarak kullanıldığını belirtiyorlar. Ancak yeni koronavirüs salgının başında (bu makalenin yayımlandığı zamanlar), bu virüs stoklarına sahip olmayan bir çok ülke olduğunu söylüyorlar. Bu nedenle, yeni koronavirüsün SARS virüsü ile benzerliğine dayanarak, ellerinde SARS virüsü veya RNA’sı bulunan laboratuvarların bunu pozitif kontrol olarak kullanabileceğini bildiriyorlar. Bunun için, RdRp (ORF1a/b içinde), N ve E genlerinde, dizilimi iki virüste neredeyse aynı olan bölgelere bağlanabilecek primerler tasarlayıp bu primerlerin dizilimlerini de paylaşmışlar. Alternatif olarak, sentetik olarak üretilen nükleik asitlerin de pozitif kontrol olarak kullanılabileceğini belirtiyorlar. Çoğaltılmak istenen bölgeyle aynı dizilime sahip RNA parçaları tasarlayıp, üreterek deneysel olarak da bunu gösteriyorlar. Sentetik RNA’ları, özellikle yeni koronavirüse özgü bölgeleri çoğaltmaya çalışırken pozitif kontrol olarak kullanmak mümkün.
2- Zhejiang University, 2020
Bu yayın, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi’ndeki sağlık çalışanları tarafından, Çin’deki klinik vakaların nasıl tanı konulduğunu ve tedavi edildiğini ilk elden anlatan bir el kitabı olarak basılmış. Yukarıdaki linkten Türkçe dahil farklı dillere çevrilmiş versiyonlarını indirebilirsiniz. Ben burada yalnızca tanı kısmına kısaca değineceğim.
Tanı için kullanılan temel yöntem, yeni koronavirüsün (SARS-CoV-2) nükleik asidinin (genetik materyali olan RNA’sının) PCR temelli yöntemlerle kontrol edilmesidir. Bu işlem için hastanın üst solunum yolundan (boğaz ve/veya burun içi) veya alt solunum yolundan (balgam, akciğer sıvıları) örnek alınması gerekiyor, ek olarak dışkı veya idrardan da örnek toplanabiliyor. Araştırmacılar virüsün çoğalmak için en çok, tip 2 alveol hücrelerini (AT2) tercih ettiğini, bu yüzden de balgam ve diğer alt solunum yolu salgılarının viral nükleik asit için en yüksek pozitiflik oranına sahip olduğunu belirtiyorlar. Bu nedenle test için ilk olarak bu örneklerin tercih edilmesini öneriyorlar. Virüsün hücrelere girip, çoğalıp, hücreleri patlatarak yeni bölgelere yayılması 3–5 günü bulabiliyor. Bu nedenle ilk günlerde negatif çıkan ama belirtileri olan hastalara her gün yeniden test yapılması gerektiğini belirtiyorlar.
Tanı için 3 farklı genden, ORF1a/b, N ve E, çoğaltma işlemi yapılmasını öneriyorlar. Bu 3 işlemden en az 2'sinin sonucunun pozitif çıkması durumunda, örneği de pozitif olarak kabul ediyorlar.
Çalışmadaki ilginç sonuçlardan biri de şöyle: Solunum yolu örneklerinden nükleik asit testi pozitif çıkan hastaların %30–40 civarının kanında, %50–60 civarının ise dışkısında da viral nükleik asit bulunmuş. İdrarda ise bulunan miktar oldukça düşük. Tabii, her örnek için doğru zamanlama farklı olabilir.
3- Amanat et al., 2020:
Bu makalede ise araştırmacılar, yeni koronavirüs (SARS-CoV-2) tanısında rutin olarak kullanılan PCR temelli testlere alternatif olarak, serolojik bir test geliştirmişler. Bu test daha çok, enfeksiyonun başında tanı koyma amacıyla değil, devam etmekte olan veya geçmiş ama fark edilmemiş enfeksiyonları belirlemek amacıyla kullanılıyor. Diğer kullanım amaçları da iyileşmiş hastalarda yeterli bağışıklık oluşup oluşmadığını kontrol etmek, yeniden hastalığa yakalanma ihtimalini değerlendirmek ve iyileşmiş kişilerden alınacak kan serumunun tedavi amaçlı kullanılıp kullanılamayacağını belirlemektir. Benzer metotları kullanan ticari kitlerden bazılarının onay almasına rağmen, bu kitlerin içeriği ve doğrulukları konusunda yeterli bilgi bulunmuyor. Bu çalışma, birçok laboratuvarın uygulayabileceği basit ve güvenli (tüm virüsün kullanılmasına gerek olmadığı için) bir protokol hazırlayan ve bu yöntemi tüm ayrıntılarıyla anlatan ilk makalelerden biri.
SARS-CoV-2 virüsünün diken (spike, S) proteini en dış yüzeyde bulunduğu ve bizim hücrelerimizdeki reseptörlere bağlanabildiği için bağışıklık sistemimiz tarafından tanınmaya en müsait protein. Dolayısıyla, vücudumuza virüs girmişse bağışıklık sistemimiz bu proteine bağlanabilen antikorlar üretmeye başlar (neredeyse sınırsız genetik kombinasyonlar oluşturan bir mekanizma sayesinde). Bu şekilde üretilen bağışıklık cevabı virüsü tamamen temizlemeye yeterse iyileşme gerçekleşir. Bağışıklık cevabı yeterince hızlıysa, hastalık belirtileri çok az olabilir veya hiç görülmeyebilir. Bu durumlarda bile bu antikorlar kanda uzun bir süre bulunmaya devam eder ve duruma göre haftalar, aylar veya yıllar boyunca bir koruma sağlayabilir.
Araştırmacılar da buna dayanarak S proteinlerini (antijen), bazı değişikliklerle laboratuvar koşullarında üretip, hastalardan alınan kan serumunda bu antijene bağlanabilen antikorların olup olmadığını ELISA yöntemiyle test ediyorlar. Proteinde yaptıkları değişikliklerin amacı, önceki literatür bilgilerine dayanarak, laboratuvar ortamında daha stabil kalmasını ve rahat bir şekilde saflaştırılmasını sağlamak. Alternatif olarak, S proteinin yalnızca reseptöre bağlanan bölgesini (RBD) de benzer şekilde üretiyorlar.
Ürettikleri 2 çeşit antijeni kullanarak, SARS-CoV-2 pozitif olduğu bilinen hastalardan alınan 4 farklı kan örneğini ELISA yöntemiyle test ediyorlar. Negatif kontrol olarak da, COVID-19 salgını başlamadan önce alınmış 59 kan örneğini kullanıyorlar. Negatif kontroller 2 çeşit antijene de neredeyse hiç bağlanma göstermezken, 4 pozitif örnek 2 antijene de bağlanma gösteriyor.
Çalışmada kullanılan negatif kontrollerin içinde SARS-CoV-2 dışında, nezle gibi hastalıklara yol açan diğer koronavirüslerin enfekte ettiği kişilerden alınan örnekler de var. Bu durum 2 önemli çıkarım yapmamızı sağlıyor. Birincisi, bu testin doğruluğunun diğer koronavirüsler nedeniyle azalmayacağını anlamış oluyoruz. İkincisi ise, diğer koronavirüslerle önceden enfekte olmuş olmamız SARS-CoV-2 için bir “kısmi bağışıklık” yaratmıyor. Aslında bunun bir taraftan iyi olabileceğini belirtiyorlar. Çünkü bazı enfeksiyonlardan bilindiği kadarıyla kısmi bağışıklık, bazen vücudun virüsle karşılaştığında aşırı şiddetli bir bağışıklık cevabı yaratmasına ve daha büyük sıkıntılara yol açabiliyor.
Sonuç olarak, bu çalışma geçmişe yönelik (fark edilmeyenler dahil) enfeksiyonların hızlı, kolay ve güvenli şekilde belirlenmesine olanak tanıdığı gibi, bağışıklık sürecini de daha iyi anlamamıza olanak sağlıyor. Ayrıca buradaki gibi laboratuvar koşullarında üretilen virüs proteinlerinin, aşı denemeleri için de kullanılmaya aday olduğunu belirtelim.
