Genes de resistência antimicrobiana e Bioinformática — Parte 1
Olá pessoal, no post dessa semana abordaremos mais sobre os genes de resistência antimicrobiana e como a bioinformática é uma ferramenta útil na detecção dos mesmos :D
Genes de resistência antimicrobiana
A resistência antimicrobiana (RAM) é uma questão de saúde pública que põe em risco a eficácia da prevenção e do tratamento de um número cada vez maior de infecções por vírus, bactérias, fungos e parasitas. A RAM tem gerado preocupação global, uma vez que ocorre quando microrganismos sofrem alterações quando expostos a antimicrobianos como antibióticos, antifúngicos, antivirais, antimaláricos ou anti-helmínticos, por exemplo. Os microrganismos resistentes à maioria dos antimicrobianos são conhecidos como ultrarresistentes.
Para saber mais como essa resistência pode acontecer, de uma lida no nosso post sobre a análise de genes de resistência a antibióticos com o card RGI.
A RAM e outras doenças infecciosas, juntamente das áreas da saúde estão passando por uma rápida mudança com o advento de tecnologias de sequenciamento genômico completo (WGS) acessíveis. Essas tecnologias estão ganhando aceitação rapidamente como métodos de rotina e no processo, estão transformando os procedimentos de laboratório. Essas abordagens serão melhor exploradas com o decorrer deste texto.
Em geral a análise de uma sequência completa de DNA genômico, permite a descoberta de detalhes estruturais sobre os traços individuais de um organismo ou população. Como tal, pode ser usado para fornecer identificação microbiana mais confiável, relações filogenéticas definitivas e um catálogo abrangente de características relevantes para investigações epidemiológicas. Isso resulta em um grande impacto nas investigações de surtos e no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, bem como na prática da microbiologia e epidemiologia. Em aplicações clínicas, isso inclui a capacidade de detectar resistência RAM e rastrear a evolução e disseminação da bactéria RAM em um hospital.
Ferramentas na identificação RAM
Incialmente para identificação de RAM, eram se utilizados os ensaios fenotípicos, com padrão ouro para medir a suscetibilidade antimicrobiana. O mesmo é baseado em métodos de teste de suscetibilidade antimicrobiana in vitro (AST) padronizados baseados em diluição ou difusão, onde extensas pesquisas e testes foram realizados para correlacionar as medições de AST com os resultados clínicos. Cada vez mais, métodos moleculares estão sendo usados na vigilância da resistência e, em alguns casos, também para orientar a terapia clínica. Esses métodos variam de detecção de PCR de elementos de resistência conhecidos a métodos baseados em espectrometria de massa.
Sequenciamento de Genomas
O genoma, ou material genético, de um organismo (bactéria, vírus, batata, humano) é composto de DNA. Cada organismo possui uma sequência única de DNA composta por bases (A, T, C e G). Se você conhece a sequência das bases em um organismo, já identificou sua impressão digital ou padrão de DNA único. A determinação da ordem das bases é chamada de sequenciamento.
O sequenciamento shotgun do genoma inteiro ou sequenciamento total do genoma (WGS) foi integrado as técnicas de identificação da RAM e às configurações clínicas e de saúde pública, embora o uso do WGS tenha se concentrado principalmente na identificação e rastreamento de surtos. Junto com os usos epidemiológicos, há um grande potencial para o uso de WGS para auxiliar na detecção de RAM. A avaliação precisa do conteúdo do gene RAM e permite a descoberta de novas variantes de resistência e pode servir como base para predizer fenótipos de resistência sem a necessidade de testes fenotípicos demorados.
A melhor vantagem WGS para tipagem microbiana e vigilância RAM é o nível de detalhe sem precedentes em um ensaio que pode ser usado para descrever tendências atuais e distinguir tendências emergentes. As bactérias RAM podem ser tipadas e rastreadas por perfis de alelos específicos, em vez de apenas de acordo com os padrões fenotípicos por classe de drogas. Isso é exemplificado por um estudo de Campylobacter resistente a aminoglicosídeo emergente nos EUA, onde WGS revelou que a tendência de aumento foi impulsionada por nove alelos de resistência diferentes, seis dos quais nunca haviam sido detectados em Campylobacter anteriormente e não teriam sido encontrados facilmente usando PCR.
Da mesma forma, em uma das primeiras aplicações em grande escala de WGS para investigar um surto de transmissão alimentar resistente a medicamentos nos EUA em 2011, padrões de resistência inconsistentes entre tipos PFGE indistinguíveis de Salmonella sorovar Heidelberg foram revelados por análise de sequência como um evento de contaminação polimicrobiana, envolvendo várias combinações de plasmídeos e tipos de cepas.
Vale salientar ainda que a comparação entre fenótipo e genótipo, bem como a aplicação de aprendizado de máquina ou aprendizado profundo, estão ainda em recente desenvolvimento e dados adicionais sobre espécies bacterianas além do domínio do patógeno de origem alimentar são necessários para seu progresso.
Para saber mais sobre sequenciamento genômico, temos uma série de posts que podem facilitar muito o seu entendimento, para acessar clique aqui!
Recursos online para detecção de genes RAM in sílico
O alto nível de concordância entre fenótipo e genótipo coincide com o desenvolvimento de versões novas e atualizadas de ferramentas de bioinformática que podem prever o RAM e o fortalecimento de bancos de dados de genes de RAM bem curados. Em princípio, a detecção in silico de RAM é realizada usando um algoritmo de pesquisa para consultar dados de entrada de DNA ou sequência de aminoácidos quanto à presença de um conjunto pré-determinado de determinantes de RAM contidos em bancos de dados de referência de RAM. Uma abordagem in silico para avaliar o conteúdo de RAM requer bancos de dados de genes de RAM abrangentes e precisos, bem como ferramentas confiáveis de identificação.
Existem muitos bancos de dados e ferramentas que usam uma variedade de abordagens e fontes de dados, conforme descrito em revisões recentes. Isso pode ser realizado usando sistemas proprietários oferecidos por empresas comerciais ou sistemas de acesso aberto que requerem diferentes níveis de experiência do usuário. Os sistemas de acesso aberto estão disponíveis em centros de dados do genoma público, como o Center for Genomic Epidemiology (CGE) online ou para download para instalação local no github, bitbucket e semelhantes.
Existem diversos softwares de bioinformática que podem processar dados de sequência tanto como leituras quanto como conjuntos. Geralmente, os recursos disponibilizados não incluem um controle de qualidade dos dados da sequência de entrada, portanto, é de extrema importância que os usuários garantam a qualidade das sequências ou montagens enviadas.
Após a montagem, são realizadas abordagens para comparar os dados de entrada com os bancos de dados de referência RAM, sendo as pesquisas mais comumente utilizadas BLAST e modelo Hidden Markov.
Ferramentas BLAST e Hidden Markov
O programa BLAST foi desenvolvido para a realização de buscas, através da comparação de sequências biológicas primárias. As abordagens baseadas em BLAST são capazes de identificar alelos específicos e genes intimamente relacionados.
No entanto, os métodos baseados em BLAST usam pontos de corte arbitrários que podem atribuir mal aos genes RAM ou mesmo atribuir mal a resistência a genes não-RAM (por exemplo, identificação incorreta de metalo-beta-hidrolases como metalo-beta-lactamases). Apesar desses empecilhos, os métodos baseados em montagem podem ter um valor agregado em um contexto de vigilância RAM, pois permitem a análise do contexto genético dos genes, como sua presença no potencial mobilizável.
Você pode ler ainda mais sobre como o BLAST funciona, através do nosso post sobre este tópico, clicando aqui!
Hidden Markov
Um modelo de Markov oculto (HMM) é um modelo estatístico que pode ser usado para descrever a evolução de eventos observáveis que dependem de fatores internos, que não são diretamente observáveis. Até agora, vários modelos e algoritmos de processamento de sinal têm sido usados na análise de sequência biológica, entre os quais os modelos ocultos de Markov (HMMs) são especialmente populares. Normalmente, uma sequência biológica consiste em subestruturas menores com diferentes funções, e diferentes regiões funcionais frequentemente exibem propriedades estatísticas distintas. Por exemplo, é bem conhecido que as proteínas geralmente consistem em vários domínios. Dada uma nova proteína, seria interessante prever os domínios constituintes (correspondendo a um ou mais estados em um HMM) e suas localizações na sequência de aminoácidos (observações). Além disso, também podemos querer encontrar a família de proteínas à qual essa nova sequência de proteínas pertence.
As abordagens HMM facilitam uma classificação hierárquica de proteínas RAM, de alelos a famílias de genes, mas a curadoria e validação de bibliotecas HMM são necessárias. As ferramentas também diferem conforme analisam sequências de nucleotídeos ou proteínas. Além disso, algumas ferramentas estão disponíveis apenas por meio de uma interface Web, enquanto outras podem ser operadas em servidores locais, proporcionando mais flexibilidade aos usuários. Os pesquisadores que tentam usar os bancos de dados RAM atualmente disponíveis devem escolher entre esses diferentes recursos de banco de dados.
O avanço no sequenciamento do genoma completo e a aplicação de ferramentas online para detecção em tempo real dos determinantes de RAM é essencial para estratégias de controle e prevenção para combater a ameaça crescente de RAM. No post de hoje abordamos um pouco das ferramentas acessíveis disponíveis na previsão dos determinantes RAM. Além disso, identificamos uma série de requisitos anteriores para uma transição bem-sucedida, como bancos de dados RAM com curadoria, garantindo uma alta concordância entre fenótipos e genótipos.
Espero que tenham gostado do post pessoal, deixem suas dúvidas, sugestões ou críticas nos comentários. Até a próxima!!!!
