Reprogramiranje stanica u matični oblik — mogućnosti primjene i njihova ograničenja

Autor: Emerik Galić

Već u osnovnoj školi učimo da su sva živa bića izgrađena od stanica. Postoje različiti tipovi stanica koje čine naš organizam, kao što su stanice jetre (hepatociti), mozga (neuroni), itd., za koje kažemo da su diferencirane, tj. usko specijalizirane za obavljanje određenih zadaća (funkcija) u našem tijelu. Različiti tipovi stanica zajedno tvore tkiva, organe, organske sustave i kompletan organizam.

Slika 1. Shematski prikaz reprogramiranja somatskih stanica u matični oblik. Matične stanice se nakon diferencijacije u željeni tip stanica potencijalno transplantiraju natrag u pacijenta. (izvor)

Matične su stanice poseban tip stanica koje karakterizira neograničena mogućnost proliferacije (umnožavanja) i sposobnost da iz njih diferencijacijom nastaju specijalizirani tipovi stanica. Prva je matična stanica zigota, koja nastaje oplodnjom jajne stanice pomoću spermija. Zigota ima potencijal da stvori čitav organizam pa prema tome za nju kažemo da je totipotentna. Daljnjom proliferacijom zigote dolazi do razvoja pluripotentnih embrionalnih matičnih stanica (Esc), koje imaju sposobnost diferencirati se u sve tipove stanica koje izgrađuju organizam. Razvojem organizma matične stanice imaju sve manju mogućnost stvaranja diferenciranih stanica, tako da za odrasle matične stanice kažemo da su multipotentne ili unipotentne, odnosno da imaju sposobnost diferencijacije u nekoliko ili samo jedan tip specijaliziranih stanica. Znanstvenici su uspjeli izolirati Esc i kultivirati ih u laboratoriju, što se pokazalo kao velika prekretnica u istraživanju matičnih stanica i njihovoj primjeni u medicini. Međutim, ovaj pristup uključuje manipulaciju ljudskim embrijima što izaziva velike etičke prijepore u znanstvenoj zajednici i šire (1).

Donedavno se smatralo da diferencirane stanice nužno moraju ostati u tom obliku, odnosno da su terminalno diferencirane. To bi značilo da jednom kada se iz matične stanice razvije, primjerice, stanica fibroblasta kože, ona se ne može vratiti u matični oblik. Međutim to se pokazalo netočnim. John B. Gurdon i suradnici (2) 60-ih su godina provodili istraživanja na stanicama žabe. Konkretno, zamijenili su jezgru jajne stanice jezgrom stanice tankog crijeva, nakon čega se iz takve stanice razvio punoglavac. Što je to značilo? Značilo je da jezgra terminalno diferencirane stanice crijeva, u kojoj se nalazi DNA — nasljedna informacija za razvoj organizma, ima sposobnost dati uputu za razvoj čitavog organizma. Prije toga se smatralo da jedino zigota ima takvu sposobnost. Zanimljivo, ista ova tehnika primijenjena je pri kloniranju ovce Dolly.

Sljedeće su veliko otkriće napravili Shinya Yamanaka i suradnici 2016. godine (3) kada su aktivacijom 4 gena (Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc) uspjeli mišju stanicu fibroblasta vratiti u matično stanje. Danas se ta 4 faktora nazivaju Yamanaka faktorima, a ovaj tip stanica — inducirane pluripotentne matične stanice (iPSc). Gordon i Yamanaka su za svoja otkrića 2012. godine dobili Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu.

Ovim je istraživanjima otvorena teoretska mogućnost da se svaku stanicu u tijelu vrati u matično stanje te iz nje napravi neki drugi tip stanice, primjerice da se fibroblaste kože prevede u neurone mozga.

Slika 2. Mikroskopski prikaz organoida jetre generiran in vitro, pomoću matičnih stanica. (izvor)

Veliki potencijal primjene prepoznat je u transplantacijskoj i regenerativnoj medicini. Prednost je ovog pristupa to što stanice za transplantaciju nisu stranog podrijetla, već su uzete od pacijenta, reprogramirane te vraćene u istog, bez opasnosti od imunološke reakcije odbacivanja. U tijeku su kliničke studije o upotrebi iPSc-a za liječenje Alzheimerove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze (ALS) i srčanog zatajenja (4). Ipak, važno je napomenuti da do sada nijedna terapija temeljena na iPSc-u nije klinički odobrena.

Nadalje, učinkovitost farmakološke terapije izrazito je varijabilna i ovisi o individualnim razlikama u genomu različitih osoba i tipu bolesti. Upotrebom iPSc-a koji potječu od pacijenta moguće je napraviti tkivo (organoid) koji pokazuje fenotip (karakteristike) bolesti na kojem bi se mogla testirati učinkovitost dostupne terapije. Terapijom koja se pokaže učinkovitom tada bi se liječilo samog pacijenta. Osim toga, iPSc može biti korišten i kao platforma za istraživanje učinkovitosti i sigurnosti novih lijekova (5).

Koji su razlozi za to što terapija induciranim pluripotentnim matičnim stanicama nije zaživjela u praksi, unatoč velikim naporima znanstvene zajednice? Geni koji kodiraju spomenute Yamanaka faktore koji su potrebni za indukciju matičnosti, također su uključeni i u nastanak i progresiju tumora. Matične stanice i stanice tumora dijele zajedničku karakteristiku neograničene proliferacije tj. umnožavanja. Kad se matična stanica diferencira u specijalizirani tip stanice, ona gubi sposobnost proliferacije. Takvu se stanicu može sigurno transplantirati u pacijenta bez opasnosti od nekontrolirane proliferacije. Međutim, učinkovitost diferencijacije iPSc-a u specijalizirani tip stanica zasad nije dovoljno visoka da bi se izbjegla opasnost od nastanka tumora (6).

Diferenciranjem matičnih stanica cilj je stvoriti homogenu staničnu populaciju. Protokoli diferencijacije koji se trenutno koriste rezultiraju heterogenom populacijom koja istovremeno sadrži željene diferencirane stanice, druge tipove diferenciranih stanica i nediferencirane matične stanice (6) . U teoriji je dovoljna samo jedna stanica s tumorskim potencijalom da bi došlo do nastanka tumora. Dobra je vijest da je danas moguće selektirati željenu populaciju stanica tehnikama stanične biologije.

Također, kada se stanice pacijenta reprogramiraju u staničnoj kulturi (in vitro), one nužno nakupljaju mutacije. Što su stanice duže u kulturi, nakupit će se veći broj mutacija u genomu. Nužno je prije bilo kakve primjene provjeriti postojanje mutacija sekvenciranjem genoma (7).

U laboratoriju Prof. Raya-e, na institutu IDIBELL u Barceloni, imao sam priliku raditi s iPSc-om. Stanice fibroblasta kože uzete su od pacijenta sa specifičnom mutacijom povezanom s Parkinsonovom bolešću. Stanice su reprogramirane u matični oblik i diferencirane u dopaminergične neurone (8), odnosno stanice zahvaćene Parkinsonovom bolešću. Nakon diferencijacije, tretirane su lijekom koji bi trebao smanjivati oksidacijski stres, što je značajka također povezana s ovim oboljenjem. Naš lijek nije bio efikasan u smanjenju Parkinsonova fenotipa, ali se pristup i dalje koristi za testiranje drugih lijekova. Možda jednog dana dovede i do izlječenja same bolesti. 😊

— -

Reference:

1. Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):68.
2. Gurdon JB. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J Embryol Exp Morphol. 1962;10:622–40.
3. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663–76.
4. Cochrane Library. [cited 2022 Jul 24]. https://www.cochranelibrary.com/search
5. Doss MX, Sachinidis A. Current Challenges of iPSC-Based Disease Modeling and Therapeutic Implications. Cells. 2019;8(5):403.
6. Yamanaka S. Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy — Promise and Challenges. Cell Stem Cell. 2020;27(4):523–31.
7. Kuijk E, Jager M, van der Roest B, Locati MD, Van Hoeck A, Korzelius J, et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nat Commun. 2020;11(1):2493.
8. Sánchez-Danés A, Consiglio A, Richaud Y, Rodríguez-Pizà I, Dehay B, Edel M, et al. Efficient generation of A9 midbrain dopaminergic neurons by lentiviral delivery of LMX1A in human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Hum Gene Ther. 2012;23(1):56–69.

— -

O autoru:

Emerik je završio prediplomski studij biologije na Sveučilištu J. J. Strossmayera u Osijeku i diplomski studij molekularne biologije na Sveučilištu u Zagrebu. Trenutno je doktorand na Sveučilištu J. J. Strossmayera u Osijeku gdje pohađa Poslijediplomski studij Molekularne bioznanosti. U istraživanju se fokusira na in vitro procjenu biološkog učinka nanočestica. 2021. godine je 2 mjeseca boravio u Barceloni, gdje je učio napredne metode stanične kulture i metode održavanja matičnih stanica.