細胞培養肉の科学

このページは、Good Food InstituteのSenior ScientistであるElliot Swartzさんの個人ブログを本人の許可のもとで、Shojinmeat ProjectにてDeepLを使って機械翻訳したものです。原著者は新たな論文が出る度に更新をしておりますが、本邦訳版は2020/06/20時点のページを元に行われている。なお、元ページ(英語)はこちらです： http://elliotswartz.com/cellbasedmeat/cleanmeat301

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以下、本編です。
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培養肉サイエンスシリーズ I：細胞株

序章

培養肉とは、動物の幹細胞を成長させて、動物を屠殺することなく食用の食肉製品にすることを可能にする、現在開発中の技術である。また、クリーンエネルギーやクリーンプロセスと同様にクリーンミートや、培養された肉 (cultured meat)、細胞ベースの肉 (cell-based meat) とも呼ばれる。現在、世界には50社以上の企業が広がっており、従来の動物性肉と同等の美味しさと手頃な価格の培養肉製品の製造に取り組んでいる。しかし、成功を収めるためには、細胞・分子生物学、組織工学、化学工学など、様々な分野からの科学者の積極的な参入が必要である。本連載では、培養肉生産に関わる中核的な科学分野（下図）を概観し、技術開発の経緯、成功のために克服すべき科学的ハードル、そして食の未来を形作る可能性を掘り下げていきたいと思う。

培養肉を商業化する上での最大の障壁は、コストの低減と規模の拡大である。これを達成するためには、細胞株開発、細胞培養培地、バイオリアクターとバイオプロセシング、そして足場となる生体材料という4つの重要な分野でイノベーションを起こす必要がある。この包括的なシリーズでは、様々な科学分野からの既存の文献を要約し、これらの4つの分野に関連するように文脈化している。これらの領域はパズルのピースとして提示され、成功を収めるためにはすべてが開発に必要であることを強調している。Swartz、2019年より。

培養肉生産に使用される細胞株は、最終的に考慮すべき下流の変数の多くを決定する。出発原料としては、自己複製が可能で、食肉の組織を構成する細胞（筋線維、脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞など）に分化できるものが最も魅力的である。つまり、まずは幹細胞から始める必要がある。 幹細胞増殖の開始には、その能力や多様な細胞種別に分化する能力によって、いくつかの異なる可能性がある（図1）。 例えば、胚性幹細胞は3つの発生生殖細胞層（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力を持っているが、成体幹細胞は一般的に、より専門性が高く、同じ生殖細胞層や臓器型の細胞を作ることに限定されている。培養肉生産に使用される可能性の高い開始細胞の種類は、表1に概説されており、以下で説明する。

Figure 1. A visualization of stem cell potency. Image from TechnologyNetworks.

全編を通して論じないが、肝細胞に由来するフォアグラのような他の食材の生成のために、特定の器官または組織からの初代細胞株を使用することも可能である。またはフィッシュ・モウ（魚の浮き袋）のような他の器官組織の生成のために使用することも可能である。 乳の栄養成分（乳酸塩、乳固形分、乳清など）を生成する乳腺上皮細胞の増殖を利用して、ヒトまたは動物の乳製品を生成することもできる。 非肉製品は、細胞農業という大きな傘の下に位置し、動物、植物、または微生物の細胞から生産された木材、皮革、酵素などの農産物をも含む。

表1. 培養肉生産に使用される可能性のある出発細胞の種類。いずれも現在、培養肉業界の企業で検討されているものである。

多能性幹細胞

胚性幹細胞を培養肉生産に利用するためには、まず胚性幹細胞株を入手する必要がある。 胚性幹細胞は、受精後数日で形成される胚盤胞と呼ばれる初期の胚構造の内部の細胞塊から得られる（図2）。 1981年、マウスに由来した胚性幹細胞株を最初に、その後、ヒト、ヒト以外の霊長類、ラット、ニワトリ、魚を含むいくつかの選ばれた種が続いた。しかし、安定した胚性幹細胞株の誘導は非常に困難である。胚性材料の入手や作業が難しく、細胞はその増殖基質に非常に敏感であるため、自然分化せずに増殖を維持するためには、種によって異なる増殖因子や阻害剤の組み合わせが必要である。 実際、肉牛からの胚性幹細胞株の導出は、2018年に最近達成されたばかりである(Bogliotti et al. 2018)。したがって、培養肉がすべての一般的に食べられる動物種で利用できるようにするためには、多様な種の組み合わせで真性胚性幹細胞株を樹立する重要な仕事が残っている。

図2. 多能性幹細胞の一種である胚性幹細胞の導出。UMass医学部より。

別の方法として、細胞再プログラミングと呼ばれる技術（図3）を利用して、胚由来ではなく胚性幹細胞の望ましい特性を維持した人工多能性幹細胞（iPSC）を得ることができる。 細胞再プログラミングは、最終的な細胞型を定義する重要な遺伝子セットの発現によって、ある細胞型を他の細胞型に直接変換することを可能にする（Rackham et al. 2016）。再プログラミングは、ウイルス媒介による転写因子の過剰発現を介して、恒久的なゲノム統合（例えば、レンチウイルスの使用を介して）、またはウイルス型に基づく確率的な非統合発現（例えば、センダイウイルス（Fujie et al. 2014）を介して）のいずれかを介して行うことができる。 しかしながら、再プログラミングは、エピソームまたはmRNA遺伝子デリバリー（Schlaeger et al. 2015）、タンパク質（Cho et al. 2010）、または小分子（Zhang et al. 2012）のような追加の非統合的方法によっても達成され得る。 iPSCの生成は、山中因子と呼ばれる転写因子遺伝子Oct4、Klf4、c-Myc、およびSox2の標準的なセットを過剰発現させることにより、白血球や皮膚線維芽細胞のような容易に得られる細胞を含む、実質的にあらゆる成体細胞から行うことができる（Takahashi and Yamanaka 2006）。 これらの遺伝子は高度に保存されているため、ほとんどの農業関連種からiPSCが生成されているが、魚のiPSCまたは他の海洋種由来の例は稀である（Rosselló et al. 2013）。 したがって、iPSCは、その機能性において一般的に同等でありながら、胚性幹細胞よりも誘導しやすいのが一般的である（Choi et al. 2015）。

図3. リプログラミングは、ある細胞タイプから別の細胞タイプへの変換を可能にする。Srivastava & DeWitt, 2016より。

再プログラミングの使用は、技術的には、出発点となる他の細胞型（例えば、線維芽細胞）を筋肉（Ito et al. 2017）、脂肪（Wu, Jin, and Gao 2017）、または他の細胞型に直接変換（transdifferentiated）し、完全にiPSCの状態をバイパスすることを可能にする。 このアプローチは、出発点となる細胞株として線維芽細胞を使用しているイスラエルに本拠を置く培養肉会社Future Meatが使用していると思われる。形質転換戦略は、変換効率が不完全かつ変動しやすいため、その適用範囲がやや限定的であり、それは限定的に拡張された有糸分裂後の細胞集団をもたらす（Prasad et al. 2017）。 培養肉の生産には過剰に多くの細胞が必要であることを考えると（第二章で議論する）、分化転換の前に増殖させなければならず、変換されていない細胞はすべて無駄になり、バイオプロセスの全体的な効率に影響すると考えられる。 それにもかかわらず、これらの再プログラミング技術は、導入遺伝子に関する法制上の潜在的な規制を回避するために、非インテグレーディング法を用いて追求されてゆくだろう。

成体幹細胞

間葉系幹細胞

成体の多くの組織には、傷害や細胞死、あるいは正常な細胞交替によって細胞群を補充するために必要な幹細胞が貯蔵されている。 これらは成体幹細胞と呼ばれている。 最も研究されている成体幹細胞の一つが間葉系幹細胞（MSC）で、間葉系間質細胞と呼ばれることもある（図4）。 MSCは骨髄や脂肪組織の生体組織検査から得られる精製細胞群から得られるのが最も一般的だが、胎盤、歯髄、臍帯など他の供給源も使われている。 実際、組織供給源の様々な組み合わせとその結果生じる細胞の表現型は、 MSCをどのように定義すべきだろうか、またそれが幹細胞なのだろうかという疑問を投げかけている（Sipp, Robey, and Turner 2018）。 国際細胞治療学会（International Society for Cell Therapy）（Dominici et al. 2006）のガイドラインは、より良いMSCの定義を示そうとしているが、細胞表面マーカーの発現のようないくつかの基準は、ヒト以外の種では適用できない可能性があり、定義しなおす必要があるだろう。 さらに、MSCは一般的に骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞を形成する能力がある事と部分的に定義されているが、MSCの骨格筋細胞を形成する能力はやや限定的で、組織の供給源に依存する可能性がある。 一般的に、MSCの分化経路に偏りを持たせるために、特定の細胞培養培地で細胞を培養することによって、MSCの多能性を利用することができる（シリーズIV、パートCでさらに議論する）。 したがって、MSCは、容易に入手可能で、肉の主要な細胞成分を作ることができる出発細胞の供給源となる。

図4 間葉系幹細胞の特徴 間葉系幹細胞は、細胞表面のマーカーと細胞型の配列を作り出す能力によって特徴づけられる。これらの細胞をどのように定義するかが問題視されている。 Source.

線維芽細胞・筋線維芽細胞・線維化前駆細胞

骨格筋の恒常性維持には、様々な種類の常駐筋細胞が関与している。 筋結合組織を構成する細胞外基質成分の沈着は、恒常性、修復、および再生を導く上で重要な特徴だ（シリーズIII、パートAでさらに議論する）。 この細胞外基質の沈着は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、および線維原性前駆細胞を含む細胞型から筋肉内で起こり得る。 線維原性前駆細胞は、筋線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、または骨形成細胞に分化することができる間葉系前駆細胞の特別なタイプであるが、筋芽細胞には分化しない（Biferali et al. 2019）。 骨格筋管自体の産生には関与しないが、線維原性前駆細胞は、筋形成および筋原性分化を増加させるか、または影響を与える様々な成長因子およびサイトカインを分泌することができる(Wosczyna and Rando 2018)。 これらの細胞型はまた、特に疾患の文脈において、結合組織内の線維芽細胞および脂肪細胞の蓄積に影響を与えることが知られている。 これらの線維芽細胞集団の定義の特徴がまだ解明されていないことを考えると、骨格筋組織に由来する間葉系幹細胞集団を扱う研究者は、実際には部分的に不均一な線維芽細胞集団を培養することになる可能性がある。 これらの細胞タイプの役割については、シリーズIV、パートCおよびシリーズVでさらに議論する。

筋サテライト細胞

成体の骨格筋組織に常駐する幹細胞集団は、筋サテライト細胞またはサテライト細胞と呼ばれている（図5）。 サテライト細胞は筋組織の基底ラミナの下にある筋線維と並んで存在し、損傷やストレスを受けて活性化されるまで静止したままである。 マウスでは、筋組織1mgあたり約550個のサテライト細胞が存在し（Bentzinger, Wang, and Rudnicki 2012）、体内で最も豊富な組織特異的幹細胞集団の一つとなっている。 サテライト細胞は、局所麻酔下、または死後まもない動物の小さな筋肉生検から得られ、よく特徴づけられた細胞表面マーカーの配列に基づいて研究室で精製することができる(L. Liu et al. 2015)。 しかし、常駐筋の微小環境（ニッチ）の外で生体外で（in vitro）でそれらの増殖能力を維持することは困難であり、活発に研究されている。 組織特異的な幹細胞として、活性化された衛星細胞は筋芽細胞を容易に産生し、最終的には筋細胞、多核化筋管、筋線維の形成につながり、それぞれの細胞は重要な転写因子の発現によって区別される(Chal and Pourquié 2017)。 サテライト細胞が間葉系の代替経路に入り、脂肪細胞などの他の細胞型の生成につながるという証拠もある(Shefer, Wleklinski-Lee, and Yablonka-Reuveni 2004)が、これは反論されている(Starkey et al. 2011) したがって、サテライト細胞は、in vitro で骨格筋組織を得るための最も直接的な方法を提供するが、肉の他の細胞成分の作成のための理想的な出発細胞ではないのかもしれない。

図5 多能性幹細胞が骨格筋の系統を下っていく様子。Pax3やPax7などの転写因子がサテライト細胞の集団をマークしている。 From Chal & Pourquie, 2017.

細胞バンク

どのようなバイオプロセスにおいても、再現性があり一貫性のある細胞株が不可欠です。 培養肉を大規模に製造するために必要な、大量の細胞群の増幅には、遺伝的ドリフトと細胞株の安定性に対する大きな懸念があり、これが下流工程や最終製品の不具合につながる可能性があります。 本質的には、細胞がDNAを分裂・複製し続けると、遺伝的変動（一塩基多型、コピー数の変動、大規模な挿入や欠失、エピジェネティックな変化、または異数性）の負担が増大する可能性も高くなる。 いくつかのケースでは、これらの変異は、改良された処理のために利用することができる（例えば、懸濁培養への適応または成長因子の低濃度化、シリーズIIで議論されている）が、しかしながら、一般的に、遺伝的安定性は、再現性のある処理に有利である。

図6 セルバンク作成の一般的な概要. From Paul Mozdziak.

遺伝的ドリフトのリスクを軽減するためには、細胞を最初に増殖させ、厳格な品質管理を介して検証し、マスター細胞バンクとして凍結保存する必要があります（図6）。 その後、マスターバンクからの個々のバイアルを連続的に亜培養して、実用的な細胞バンクを生成することができます。 動物由来のフリーで化学的に定義された凍結保存技術は、様々な種からの多様な細胞タイプのセットのために最適化する必要があります。 この戦略は、培養肉のバッチ処理や前駆幹細胞の連続処理を可能にし、少なくとも十分な違いが検出されるまでは、培養を再開することができるようにすることができます。 同様の戦略は、ワクチン製造などの他の生物医学産業ですでに採用されており、培養肉産業の指針となる可能性がある。

現在のところ、細胞を用いた食肉生産のために、農業関連種から得られる上記の細胞型の公開された細胞株はほとんど存在していない。 したがって、バンク化し、学術界や産業界の研究者に配布することができる新しい細胞株の作成のための大きなニーズがある。 これらのバイオリポジトリは、絶滅の危機に瀕した動物の保護や大規模な流通ネットワーク（例：アメリカ型培養コレクション）に関連した取り組みのための組織や細胞株の収容に特化したものと同様に設置することができる。 多様な動物種から多くの細胞株を入手できるようにすることは、培養肉産業が長期的に繁栄するために必要とされる研 究を後押しする上で最も重要な要素の一つとなるだろう。 Good Food Instituteは、この目標を達成するためのプロジェクト「Frozen Farmyard」に資金を提供しており、試薬を提供するKerafastと提携して、培養肉用のバイオレポジトリに細胞株を収容している。 ご自身の細胞株を寄託する方法をご希望の方や、リポジトリに収容してほしい既存の細胞株の提案をお持ちの方は、cells@gfi.org まで電子メールでご連絡ください。

種の違い

幹細胞株を培養するための知識の多くは、細胞を用いた治療や再生医療の分野から得られたものである。 細胞を用いた食肉生産に使用できる実験技術、プロトコール、試薬には多くの基本的な類似点があるが、重要な違いは、異なる動物種からの細胞の培養にある。 以前に説明した細胞型を使用して発表された文献の大部分は、ヒトとマウスの研究から来ている。 ウシ、ブタ、卵巣、鳥類、リスキン動物の幹細胞を用いた研究例は存在するが、この分野全体としては、確立されたプロトコールと、そこから得られる豊富な科学的文献の程度が不足している。 にもかかわらず、ほとんどが企業が非公開で保有している膨大な量の情報が、家畜種の細胞生物学や遺伝学に関する情報として存在しており、これらの情報は家畜種を細胞培養に適応させるために活用される可能性がある。 さらに、洗練されたゲノムアノテーション、検証済み抗体、その他のオミクスデータセットなどのリソースも必要である。 最後に、重要な発生プロセスは一般的に進化によって保存されているが、ヒトやマウスを用いた細胞培養戦略を甲殻類や魚類のような進化的に遠い種に適用した場合、種の違いがどの程度成功に影響を与えるかは不明である。 したがって、全体的な生物学的プロセスは種から種へと複製される可能性が高いが、有利な場合も不利な場合も、進化的に多様な種のセットに固有の生物学的差異があるために、重要な違いが予想される。

細胞株に関する考察

他の細胞株選択戦略は、個々の動物からの複数の細胞株の生成、動物内の異なる生検部位の生成、同じ種または品種内の異なる個体の生成、または各由来の細胞株のクローンの生成を伴うことができる。 例えば、選択的育種は、特定の動物種で望ましい形質を生産しており、したがって、これらの同じ形質を戦略的にin vitroで再生産することができる（例えば、骨格筋生産のためにベルギーブルー種とホルスタイン種の牛を使用する）。 アルゼンチンを拠点とするセルファーム・フードテック社は、アルゼンチンのユニークな牛種から間葉系幹細胞株の生産を目指しており、米国を拠点とするJUST社は、日本の鳥山農場と提携して有名な和牛を再現することを目指している。 可能であれば、細胞株は、不定菌のリスクを減らすために、閉鎖された群れ、群れ、コロニーで飼育され、既知の特定病原体が存在しない動物から取得する必要があります。

最初の細胞生検の場所もまた、下流の影響を及ぼす可能性がある。以前に議論したように、これは間葉系幹細胞集団の分化の可能性に影響を与える可能性がある。ミオサテライト細胞の場合、早引き筋繊維の領域からの筋生検は、早引き筋繊維の産生にバイアスをかけ、培養中の細胞の最終的な味、食感、代謝率に影響を与える可能性がある(Y.-C. Huang, Dennis, and Baar 2006)。しかし、多能性幹細胞株間の個体差やクローン差は、管理が困難な問題として知られている(Kyttälä et al. 2016)。これらのことを考慮すると、培養肉生産に最適な細胞株を決定するために、多くの種、幹細胞のタイプ、細胞株の変数が探索されることになるだろう。しかし、動物ではなく細胞培養を用いて食肉を生産することの固有の利点の一つは、生検から製品のパッケージングに至るまで、リアルタイムの試験、データ分析、パラメータの反復が可能なことである。これらの利点は、従来の畜産に比べて、成功に到達するためのイノベーションの速度を加速させ、新製品を生み出すことができます（シリーズVで説明します）。

細胞増殖と不死化

一般的に、細胞株選択後の培養肉生産のプロセスは、増殖と分化の 2 つのフェーズに分けることができる。増殖段階では、幹細胞は分裂を繰り返して大量の細胞を生成し、新しい環境に移植され、足場の変化（シリーズIIIで説明）、培地組成の変化（シリーズIVで説明）、またはその両方を介して成熟細胞型への分化を誘発するまでの間、増殖を繰り返す。

多数の細胞を得る上での一つのハードルは、細胞が分裂することができる回数がヘイフリック限界に基づいて本質的に制限されているということである。ヘイフリック制限は、各細胞分裂に続くエンドキャッピング染色体テロメアの劣化のために、細胞分裂に制限を課す。ある一定数の細胞分裂が起こると（通常、ヒト細胞の場合はin vitroで約30〜50個）、細胞は老化状態に入り、分裂を停止します。したがって、単一の開始バッチから得られる潜在的な細胞の数は生物学的に制限されている。しかし、いくつかの細胞は、ヘイフリック限界を回避し、細胞の不死を達成することができます。多能性幹細胞は、エピジェネティックな変化(Hochedlinger and Jaenisch 2015) およびテロメア分解を防ぐ酵素テロメラーゼのアップレギュレーション(Y. Huang et al. 2014) によって、その一部で不死を達成する。この特性により、多能性幹細胞は初期のスケーリングに特に有用であるが、増殖中の遺伝的ドリフトは細胞の老化やアポトーシスにもつながる可能性がある。

成体幹細胞の中にはテロメラーゼの発現を保持できるものもあるが(Hiyama and Hiyama 2007)、不死性を獲得するには不十分である。代替的な方法の一つは、通常の細胞チェックポイントを迂回して自然不死化を達成するために、十分な数の突然変異がin vitroで蓄積されることに頼ることである。研究に使用されている多くの細胞株は、自然不死化された細胞株に由来しているが、突然変異の負荷は、予測不可能な方法で細胞の生物学的変化をもたらし、潜在的にその有用性を制限する可能性がある。さらに、種や細胞タイプ間の生物学的変異は、自然不死化や細胞形質転換の確率に影響を与える可能性がある。例えば、癌細胞形質転換に対して高い抵抗性を有する裸モグララットは、接触阻害に対して過敏であり(Seluanov et al. 2009) 、iPSC再プログラミングに対して抵抗性である(Tan et al. 2017)。高いテロメラーゼ発現を保持するロブスターおよび魚(Klapper et al. 1998; Gomes, Shay, and Wright 2010)、またはp53腫瘍抑制因子(Sulak et al. 2016) の複数のコピーを有するゾウのような他の種は、したがって、in vivoでのテロメラーゼ発現レベルは必ずしもin vitroで観察されたものと相関しないが(Venkatesan and Price 1998)、それぞれ形質転換を達成しやすく、また達成しにくいかもしれない。これらおよび既知または現在知られていない他のユニークな動物特性は、培養肉生産のために戦略的に利用される可能性がある。

複数の細胞株やクローナル株を持つことで、企業は下流で最も優れた特性（例えば、増殖率や分化能など）を持つ株を選択することが可能になり、同じ特性を獲得するための指示進化のような手間のかかる戦略を回避できる可能性があります。例えば、細胞増殖は、時間の経過とともに自然に発生する変異によって促進され、それによって細胞増殖に関連する変異体に選択的優位性が付与される。ヒト多能性幹細胞の大規模なバッチの配列決定により、染色体異常(Amps et al. 2011) やp53の優性陰性突然変異(Merkle et al. 2017)によって増殖の優位性が付与されることが観察された。これらの特異的な異常がヒト以外の幹細胞で自然に発生するかどうかは不明であるが、それにもかかわらず、クローン集団または複数の個体から選択された幹細胞株は、構築中のバイオプロセスでの有用性を促進するユニークな変異を保有している可能性が高い。

図7. テロメラーゼと細胞周期遺伝子CDK4の過剰発現を用いた可逆的な筋芽細胞不死化戦略。不死化は、正常な細胞株がヘイフリック限界を克服し、増殖を継続することを可能にします。不死化は、緑色で示されているCre-Loxシステムを使用して逆にすることができます。 From Robin et al, 2015.

標的化された不死化アプローチは、外因的に添加された遺伝子やウイルスタンパク質を過剰に発現させることで達成することができる。これらの場合、テロメラーゼの過剰発現とp16またはRbなどの細胞周期遺伝子の阻害との組み合わせ(Tsutsui et al. 2002) 、またはSV40ラージT抗原(Jha et al. 1998)またはアデノウイルス5型E1遺伝子(Sieber and Dobner 2007) などのウイルス要素の使用は、細胞の不死化のために利用されてきた。精密遺伝子編集法（例えばCRISPR）を併用して、これらの遺伝子をセーフハーバー遺伝子座(Sadelain, Papapetrou, and Bushman 2011),に挿入することで、グローバルな遺伝子発現の変化のリスクを最小限に抑えることができる。さらに、遺伝子工学的戦略のタンデム使用は、Cre-loxまたはFlp-FRT組換え(Robin et al. 2015; Westerman and Leboulch 1996) またはpiggyBacトランスポゾン(Xie et al. 2016)システムの使用により、不死化のためのON-OFFスイッチを作成することができる。したがって、不死化は容易に標的化または逆転させることができるが、有意な遺伝子改変および遺伝子工学の使用が排除的な規制基準を正当化する可能性があるため、自然不死化または意図的に不死化された系統がどのように規制されるかは、現在のところ不明である。

不死化されていない幹細胞の増殖率を改善したり、増殖能力を維持したりする方法も存在する。例えば、筋芽細胞において、小分子化合物の使用は、増殖経路の標的化(Bar-Nur et al. 2018) またはSTAT3(Tierney et al. 2014)、p38(Ding et al. 2018)、およびSetd7(Judson et al. 2018) のような特定のタンパク質の阻害を介して、増殖能力の維持を支援することができる。他の戦略には、サイトカインの存在下での増殖(Fu et al. 2015)、運動後に通常放出される小ペプチドの添加(Vinel et al. 2018)、または胎児の酸素レベルをより密接に模倣する可能性のある低酸素環境下での細胞の増殖を介して、損傷状態または再生状態を模倣することが含まれる(W. Liu et al. 2012)。同様の戦略は、脂肪細胞または軟骨細胞のような他の細胞タイプにおける生化学的経路を調整することができる。同様の結果を得るために、多くの遺伝子工学的手法も採用することができる。これらには、誘導性または構成活性系を介した遺伝子の過剰発現、および遺伝子の阻害またはノックアウトが含まれる。一般的に、生体外で幹細胞のニッチを模倣して幹を保持することは、活発な研究分野であり、培養肉生産のためにこれらの戦略を実施するための広範な可能性が存在する（詳細はシリーズIIIで）。

シリーズIIでは、培養肉のバイオプロセスに関する考察に焦点を当てます。

# 培養肉サイエンスシリーズ II：バイオプロセシング

序章

養殖食肉生産の目標が、工業的畜産による食肉消費量を大幅に減らし、それに伴う負の影響を減らすことであるならば、大量の食肉を手頃な価格で効率的に生産する必要がある。現在のところ、市場には養殖肉製品は存在しないが、鴨肉、鶏肉、サーモン、ブリ、エビ、ポークソーセージ、フォアグラ、魚卵、脂身、ビーフミートボール、ビーフハンバーグ、ビーフステーキストリップなど、いくつかの 養殖肉製品が試食されている（下の画像）。しかし、ベンチスケールの方法からパイロットスケールおよび商業スケールの生産に移行するには、細胞生物学および工学的最適化における重大な技術的ハードルを解決するために、幅広い分野からの有能な科学者の流入が必要である。これらのハードル、解決のための潜在的な戦略、培養肉のスケールアップへのロードマップを以下に述べる。

味見をした養殖肉製品のスナップショット。養殖サーモン（左上、右下）、魚のほぐし（中上、右中）、ポークソーセージ（右上、中下）、エビ（左下

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バイオリアクター

味覚試験用の培養肉製品は、標準的な細胞培養皿やスタックフラスコを使用して製造されてきたが、培養肉を大規模に培養するには、数千リットル以上の容量のバイオリアクターを使用する必要がある。細胞を培養する方法を根本的に変えることで、ガス交換、熱伝導、せん断応力、混合、発泡など、標準的な細胞培養技術者にとっては一般的な関心事ではない追加的な考慮事項がもたらされます。これらの技術の多くは、細胞治療、組換えタンパク質生産、または他の生物学的製剤の生産などの業界から借用することができますが、培養肉を味覚試験の域を超えて市場に出すためには、かなりの最適化が必要とされます。このためには、細胞生物学者と化学、機械、生物処理技術者の学際的な努力が必要となる。

図1. 異なる生物処理方法の簡単な模式図。 From (Meyer, Minas, and Schmidhalter 2017).

培養肉生産をベンチからパイロットスケールや商業スケールにスケールアップするためには、様々な方法を選択することができる（図 1）。広く言えば、これらの方法は、バッチ、フィードバッチ、連続、および灌流に分類することができます(Meyer, Minas, and Schmidhalter 2017)。バッチ培養では、容器を一定量の培地で満たし、細胞を最大密度まで増殖させた後、収穫するか、またはより大きな容器に移す。フィードバッチ培養では、ベッセル内で増殖した細胞は、指数関数的な細胞増殖または細胞密度のような特性を最大化するために、インラインで独立したフィードベッセルから新鮮な培地を可変速度で供給される。連続培養では、細胞をベッセル内で増殖させ、新鮮な培地を最適化された流量でインラインの供給ベッセルを介して添加し、同時に、製品、細胞、または培地を同じまたは代替の速度で独立した収集ベッセルに収集する。最後に、灌流培養は、細胞が基質または収集方法を介して保持される連続培養のサブセットであり、培地のリサイクル統合を可能にし、より小さなスペースで高い細胞密度を可能にします。各方法には潜在的な利点と注意点があり、培養肉のバイオプロセス全体で複数の方法が使用される可能性があります。

図2. 撹拌槽型反応器とエアリフト反応器の簡単な回路図。 From (Meyer, Minas, and Schmidhalter 2017).

培地がどのように混合されているか、および細胞が懸濁液中で培養されているか、または固体表面に付着しているかに基づいて分離することができる多くの異なるバイオリアクターの設計から選択することができます。動物細胞培養のために、最も一般的に使用されるバイオリアクターは、それがスケールでエアリフトリアクターと比較してより長期的な無菌性と減少したバブリングを提供するため、連続撹拌タンクリアクターです（図2; Meyer, Minas, and Schmidhalter 2017)。一般的に、連続撹拌タンクリアクターは、酸素の高い質量移動を維持しながら、機械的撹拌を介して懸濁液中の細胞の成長を可能にする。同様の懸濁液増殖結果は、より小さい最大スケールではあるが、ロッキングプラットフォームバイオリアクターおよび垂直ホイールバイオリアクターで得ることができる。懸濁液増殖はまた、マイクロキャリア（後述）を使用することにより、添付ファイル依存性の細胞で発生することができます。

現在の細胞治療とバイオ医薬品業界の動向は、6000Lまでの使い捨て、シングルユースシステムで攪拌タンクとロッキングプラットフォームバイオリアクターのための優先順位を示している。シングルユースバイオリアクターは、加熱滅菌（後述）を必要としないという利点があり、ターンアラウンドタイム、クロスコンタミネーション、水、エネルギー、およびセンサー（後述）のコストを節約することができます。したがって、単一使用のバイオリアクターは、生産のスケールアウト方法（後述）を検討する際に有利なオプションである可能性がありますが、生物学的製剤やヒト細胞治療に対する培養肉製品のバッチの比較的低い価値は、現在のモデルがより手頃な価格にすることができない限り、単一使用の技術は、おそらく培養肉のための経済的な意味をなさないことを意味します。しかし、注目すべきことに、シングルユースのバイオリアクターバッグは、製品の高価値バッチが失われないことを保証するために、高コストで厳格な規制基準を満たさなければならない様々な材料層で構成されている。したがって、より低いバッチ値と食品グレードの規制要件では、経済的に実現可能な、食品安全な使い捨てバッグを培養肉生産のためにカスタマイズしたエンジニアリングの余地があるかもしれません。ステンレス鋼製のバイオリアクターと比較して、滅菌からの水とエネルギー使用量の節約を示す単一使用のバイオリアクターの良好な持続可能性のメトリクスは、単一使用から生成される廃棄物と比較して秤量する必要があります。

バイオファーマでは、撹拌タンク式バイオリアクター容器は、動物細胞生産のために最大20,000Lの容量で使用されてきた(Li et al. 2019)。しかし、これらの容積は、バイオメディシンよりもむしろ食品および飼料産業に近い生産量を達成しなければならない培養肉には十分ではないかもしれない（図3）。エアリフトリアクターはまた、懸濁液の成長を可能にし、その混合が可動部分を伴わないため、不均一性が少なく、せん断応力が少なく（後述）、栄養分または酸素の勾配が少なく、混合を実行するために必要な電力が低くなるため、非常に大規模なスケール（例えば、>20,000L）で有利になる(Merchuk 1990)。これまでに構築された最大のバイオリアクターは、微生物細胞の増殖のために1,500,000Lを保持するエアリフトリアクターでした。このエアリフトリアクターの設計は最近30万Lにスケールダウンされ、動物の細胞増殖のためのリアクターの形状と内部の最適化のための計算流体力学モデルを使用して評価されました。これにより、2x10⁸細胞/mLの理論的な細胞密度と、年間75,000人を養うことができる単一のリアクターが得られた(Li et al. 2019)。したがって、エアリフトリアクターは、非常に大規模なスケールを達成するためのより扱いやすいソリューションを提供する可能性がある。しかし、エアリフトリアクターを用いた動物細胞培養に関する知識の不足は、そのような規模が実現される前に埋めなければならない多くのギャップを残している。動物の骨格筋、脂肪、および他の細胞タイプ（シリーズIで議論）のためのモデリングと経験的なデータ収集の作業は、エアリフトリアクターを使用して実行する必要がありますかなり多くの作業を行う必要があります。このように、残りの議論の焦点の多くは、データがより容易に変換可能である攪拌タンクバイオリアクターに頼ることになります。

図3. 規模の経済性は、生産のスループットの向上で達成される。培養肉の商品化や値下げの大きな要因は、スケールアップできるかどうかにあると思われる。 From Li et al. 2019.

最適化

バイオプロセスのスケーリング時に影響を与える重要な変数が多数ある。これらには、質量移動の効率、不均一性の回避、熱放散、インペラの形状と速度、溶存酸素（後述）、リアクターの形状などが含まれる。それぞれは、セルのタイプ、規模、および意図された下流での使用に応じて異なる影響を受ける可能性があります。これらの変数のための調整は、細胞治療および生物学的製剤の分野からの既存のプラットフォームから適応されるか、または新規なエンジニアリングによって支援され、特定のバイオプロセス、種、および/または細胞タイプにカスタムテーラーメイドされる可能性が高い。したがって、最も一般化可能な最適化または考慮事項を以下に論じる。

図4。攪拌タンク型バイオリアクター内の流体力学的力への細胞の曝露に影響を与えることができる多くの要因のいくつか。 From Schnitzler et al. 2015.

せん断応力

動物の細胞をスケーリングする際の重要な考慮事項の一つは、せん断応力にどのように対処するかである。せん断応力とは、細胞表面の液体の摩擦によって引き起こされる機械的な力である(Nerem 1991)。動物細胞は一般的に、細胞壁がないため、微生物細胞よりもせん断応力の影響を受けやすい。バイオリアクターでは、せん断応力は、懸濁液中の細胞を維持するために、インペラ（または一般的な動き）によって作成された液体の乱流によって引き起こされる可能性があります。力はバイオリアクター全体で不均一であり、乱流の複数の渦がインペラのタイプと数に応じて生成されることがありますが、大きな体積は、一般的により強いせん断力を意味します(Papoutsakis 1991)。せん断応力は、細胞の生存率(Hu, Berdugo, and Chalmers 2011) および分化(Stolberg and McCloskey 2009) に影響を与えることができる（シリーズIIIパートAでさらに議論）が、フローブレーカーの設置、細胞の適応、または培地へのポロキサマーの添加によっても緩和することができる(D. Chang et al. 2017)。

気泡の存在とその破裂もまた、スリップ速度の違いによるせん断応力につながる可能性がある。懸濁液中で培養された細胞では、気泡が小さい（直径1mm未満）ほど、せん断応力が高くなり、細胞毒性の発現率が高くなる可能性がある(Nienow 2006) がこれはマイクロキャリア上で培養された細胞には当てはまらない可能性がある（後述）。このことは、マイクロキャリアが使用される場合、ガスの制御されたバブリングに依存するエアリフトリアクターが動物細胞増殖に使用され得る可能性を開く(Li et al. 2019)。凝集体中またはマイクロキャリア上での細胞の成長は、独立して、細胞にかかるせん断力に影響を与えることができる（図４）。したがって、せん断応力の許容レベルは、各細胞株および細胞タイプごとに計算されるべきである(King and Miller 2007)。

図5. 凝集体およびマイクロキャリア戦略を用いた細胞のスケールアップのためのいくつかの戦略。 From Kropp et al., 2017.

撹拌槽バイオリアクターのせん断応力を最小限に抑えるための1つの潜在的な方法は、層流で結果として、乱流を減少させるか、または排除する方法を生産することです。これは、容器の側面に排出される上向きの液体の流れに依存する新しいインペラの設計を作成することによって達成することができ、効果的に流体自体が混合を行うことを許可し、時間の経過とともにせん断力を排除します。これらの戦略やその他の戦略（後述）は、培養肉の生産をスケールアップするために必要となるかもしれない。

接着依存性と細胞の適応

培養肉に使用されるものを含めて、大多数の細胞型は接着依存性であり、アノイキスと呼ばれるプログラムされた細胞死を防ぐためには、成長するための基質を必要とする。多能性幹細胞は、懸濁液中では足場に依存しない凝集体として成長することができるが、自然分化を防ぐためには、日常的に単細胞に解離させなければならない(Shafa et al. 2012; Zweigerdt et al. 2011)。オルガノイド培養の最近の進歩は、骨格筋管(Jiwlawat et al. 2017)を含むiPSC由来の細胞型の配列を作成するために懸濁液ベースの分化プロトコルの開発につながっているが、培養肉生産に使用される多能性由来の細胞型は、大部分がアンカーに依存している。ガストロイドを導出する最近の懸濁液プロトコルは、ソーマイト、脂肪、結合組織、骨格筋、腱、軟骨、および培養肉のビルディングブロックとして機能する可能性がある骨につながる前駆構造の作成を実証した(Rosado-Oliviery and Brivanlou. 2020)。これらのプロトコルはまた、より良いin vivoの細胞対応（シリーズIIIでさらに議論）の生理学を再要約することができるが、彼らはベンチスケール(Kim and Kino-Oka 2018) 過去のテストが限られている。最後に、凝集体ベースの培養は、せん断応力の影響を受けやすく(Chapman et al. 2014)、その結果、単一細胞懸濁液培養に比べて細胞の生存率が低く、細胞密度が低くなる可能性があるが、これらの制限は克服できる可能性が高い(Lipsitz et al. 2018)。スケールアップ戦略のスナップショットは、図5に記載されている。

図6. マイクロキャリアは、付着細胞がバイオリアクター内で増殖するための表面を提供します。Image source.

ミオサテライト細胞や間葉系幹細胞のような成体幹細胞タイプもまた、アンカーに依存しており、この制限を回避するために、マイクロキャリア上の懸濁液で頻繁に増殖されています（図6、シリーズIIIパートAでさらに議論されています）が、スフェロイド培養は有望な代替手段です(Alimperti et al. 2014; Jossen et al. 2018)。しかしながら、懸濁適応に固有の生物学的制限はない。例えば、生物学的製剤の生産に広く使用されている付着性上皮性チャイニーズハムスター卵巣細胞型は、懸濁液成長に適応し、インビトロでの経時的なタンパク質産生の最大化などの特定の形質のために最適化されている。対照的に、細胞療法として使用される間葉系幹細胞は、多くの場合、自然界では自己組織化されており、最小限のスケーリングと、体内に再侵入する前の細胞株の最適化を必要としない(Galipeau and Sensébé 2018)。大規模な生物処理（例：100万用量）と確立された細胞株を用いた最適化を必要とする既製の同種移植製品の開発は、まだ黎明期にある。培養肉は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を使用した生物製剤分野と同様の適応戦略を命じることになるだろうし、最小限に操作した自家間葉系細胞療法と同様の適応戦略を命じることになるだろう。

細胞の適応には、自然選択または補助選択、指示された進化戦略(Tizei et al. 2016)、または遺伝子工学(Lee et al. 2016)など、様々な選択肢が存在する。注目すべきことに、種の違いはまた、昆虫筋芽細胞(Rubio et al. 2019) およびエビの細胞株の懸濁成長への効率的な適応によって例示される、懸濁成長の可能性を決定する可能性がある、とShiok Meatsの科学者は述べている。いくつかの不死化細胞株（シリーズIで議論されている）は、不死化の方法に依存して、懸濁液中での成長を可能にするアンカー依存性を獲得することができる(Kovalevich and Langford 2013; Qu et al. 2015)。最後に、脂肪細胞では、成熟時の脂質滴の蓄積および結果として増加した浮力は、従来の撹拌タンクバイオリアクターにおける培養脂肪生産のための追加の問題を提起する可能性があります(Zhang et al. 2000)。

パラクリン因子と代謝物

細胞が増殖すると、細胞は自己分泌因子および副分泌因子を放出し、これらは隣接する細胞への増殖促進または抑制のシグナルとして機能することができる。培養肉生産を目的とした高い細胞密度（すなわち、1x10⁷細胞/mL以上）では、これらのシグナルは、下流の増殖、分化、および生存率に大きな影響を与える可能性があります。計算上のインシリコモデル化は、パラクリ ンシグナルの蓄積をモデル化し、好ましい結果をもたらす方法を予測することにより、生物処理方法の選択を支援することができる（図7; Csaszar et al. 2012)。識別された望ましくないシグナルはまた、望ましいシグナルがリサイクルされ得るのに対し、濾過を介して培養物から除去され得る（シリーズIV、パートCで議論されている）。あるいは、乳酸、アンモニア(Schumpp and Schlaeger 1992)のような代謝物の高濃度、および成長因子の低濃度での細胞の増殖は、高密度およびより低い成長因子要件（例えば、無血清条件下）に耐性のある細胞を選択することができる(Sinacore, Drapeau, and Adamson 2000)。高密度増殖はまた、酸素担体(Ozturk 1996) および抗発泡剤(Velugula-Yellela et al. 2018) の添加と同様に、細胞培養培地への栄養変化を必要とするかもしれない（シリーズIV、パートCでさらに議論される）。したがって、バイオリアクター内の生物物理学的環境に特異的に適応し、増殖段階および分化段階においてそれぞれ関連するパラクリン因子または分泌代謝物に対して耐性を有する、様々な種にわたって最適化された細胞株を生成することが重要になるであろう。培養肉に使用される様々な種の脂肪細胞および骨格筋細胞の分泌物の特徴を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。

図7.摂食戦略のインシリコモデリングは、抑制性分泌因子（SF、赤線）の減少とそれに続く幹細胞集団の拡大（LTCIC、SRC）の増加を予測している。 From Csaszar et al. 2012.

有毒代謝物のために最適化された細胞株の一例は、メンフィス・ミーツ社が最近公開した特許であり、この特許は、その過程でアンモニアを消費しながらグルタミン酸のグルタミンへの細胞内変換を可能にする、遺伝的にコードされたグルタミン合成酵素を含む細胞株を記載している。したがって、アンモニアは、グルタミンの形で細胞のためのエネルギー基質を生成しながら、〜２０％還元することができる（シリーズＩＶパートＡ、Genovese 2019にさらに記載されている）。いくつかの鳥類は、グルタミン合成酵素発現の違いに起因する骨格筋で哺乳類とは異なるアンモニアを代謝することが示されている、増加したグルタミンの利用からおそらくより大きな筋管をもたらす(Stern and Mozdziak 2019)。このように、固有の種の違いはまた、バイオリアクター内の生化学的および生物物理学的環境の周りの最適化を考慮するときに遊びに来る。

プロセスのスケールダウンと計算モデリング

スケールアップを最適化するには多額の資本コストを必要とすることがあるため、高スループットの小型バイオリアクターを使用することは、バッチまたはフィードバッチプロセスのモデリングを支援することができる(Rameez et al. 2014)。これらの「スケールダウン」アプローチは、ユーザーがより大きなスケールで成長を導くことができるパラメータを最適化しながら、コストを節約することを可能にします。しかし、小容量で流量を一致させるためにマイクロフルイディクスを必要とする小型灌流バイオリアクターは遅れており、小スケールで正確にモデル化することはより困難であるかもしれません(Fisher et al. 2019)。したがって、灌流法のハイスループットモデリングのための製品は、まだ250 mLまでのボリュームを扱っている。

パラメータの最適化および他のバイオリアクター設計の検討は、計算モデルによっても支援され得る。計算モデルは、複雑なシステムの挙動のいくつかの側面を再現し、新しい条件の下で予測を行いる。これは、培養肉開発(Kahan et al. 2020)のように、負担の大きいコストと時間を伴う経験的実験を行う場合と比較して、反復の速度とパラメータ探索空間の幅を大幅に向上させることができる。エージェントベースのモデルと計算流体力学モデルの両方が、培養肉のバイオプロセスとバイオリアクターの設計と最適化、および培地の最適化（シリーズIV、パートCで議論）、足場の設計（シリーズIIIで議論）、および最終製品の特性（シリーズVで議論）などの他の考慮事項を支援するために利用することができます。ライフサイエンス企業、学術研究者、培養肉企業、非営利団体、その他の利害関係者が参加する関心グループである培養肉モデリングコンソーシアムは、コンピュータモデリングを活用して培養肉の研究開発のペースを加速させるために2019年に結成されました。

種子系列、連続処理、細胞密度

大量の細胞を大量に生産するために、作業中の細胞バンクから採取した細胞の単一バイアルからプログレッシブなスケーリングプロセスが開始されます。このプロセスは、シードトレインと呼ばれている。細胞が成長するにつれて、細胞がその成長条件に適応するラグフェーズを経て、細胞が指数関数的に増殖する対数フェーズに続いて、静止フェーズで終了します。このように、細胞が解凍された体積と比較した細胞の開始密度は、利用可能な栄養素へのアクセスと対数相に到達するまでの時間に影響を与える可能性がある(Frahm 2014)。これは、細胞の種類および種によって異なり得る(Cheng et al. 2014)。 シードトレイン戦略は、細胞が時間の経過とともに指数関数的に成長することに依存しており、個体数の倍増によって追跡され、細胞は徐々に大きな血管に移されている。このプロセスの指数関数的な性質により、最大の効率は高い個体数の倍数で達成される。しかし、集団倍増数が多いと下流の増殖率や分化能に悪影響を及ぼす可能性があり、これは様々な種類の幹細胞で観察されている(Park et al. 2008; Bonab et al. 2006)。したがって、下流の分化能や生存能を損なうことなく、迅速かつ安定した対数期の成長を達成するためには、シードトレイン開発の最適化戦略が必要である。

図8. 高密度セルバンキングは、マルチリットルのバイオリアクター内のバイアルの直接解凍を可能にし、シードトレインの時間の9日間を節約する. From Tao et al. 2011.

種子育成時間を短縮し、コストを節約するためのいくつかの戦略は、他のバイオプロセス応用ですでに考え出されており、培養肉生産にも応用できるはずである。例えば、細胞の高密度凍結保存（～10×10⁷細胞/mL）をマルチリットルのロッキングプラット フォームバイオリアクターに直接解凍することで、細胞数を増やすのに必要な日数を劇的に減ら すことができ、その結果、コストを節約することができる（図8; Tao et al. 2011)。あるいは、幹細胞は初期の段階で連続的または半連続的な バイオプロセスで増殖させ、これらのバイオリアクターからの細胞のサブセッ トを大容量タンクに直接接種するために使用することもできる。これらの場合、結合された細胞保持装置は、高い細胞密度での連続処理を可能にし、実行間のダウンタイムを節約することができる(Xiaoxia and Buser 2016; Fisher et al. 2019)。連続的なバイオプロセスはまた、複数のバイオリアクターラインを並列に操作し、異なる収穫時間によって相殺することによって近似することができる。統合された連続処理の経済モデルでは、バッチ処理と比較して、10年間の資本コスト及び運営費を55％節約できることが示されており（モノクローナル抗体の生産の場合）、連続処理の実施は培養肉企業にとって魅力的であろうことが示唆されている(Walther et al. 2015)。培養肉分野の企業の中には、現在、連続製造技術の開発に専心している企業もある。例えば、CellulaREvolutionは、新規ペプチドコーティングを使用して、時間の経過とともに細胞の付着、成長、および剥離を可能にし、新しい未熟な細胞が剥離された細胞の空間を取ることで、連続プロセスを実現することを提案している。

他の戦略は、より低い単位体積でより高密度の細胞を成長させることに焦点を当てているかもしれない。中空糸リアクターなどの灌流バイオリアクターは、高密度培養物を生成するための一例として機能し、高い自動化の可能性（後述）を有する何ヶ月にもわたって連続的な細胞増殖が可能である(William G. Whitford John J.S. Cadwell 2011; Allan et al., 2019)。Cellular Agriculture Ltdは、スケーラブルな製造のために、培養された食肉関連細胞タイプに合わせた中空糸バイオリアクターを開発している企業の一例である。さらに、直径400ミクロンのアルジネートベースのチューブ内に共押出された細胞を利用する新しい技術(Lin et al. 2019; Li et al. 2018) は、閉鎖的な微小環境内での培養肉生産をスケーリングするための多大な可能性を提供し、シードトレイン処理を完全にバイパスし、以前に議論された方法と比較して、同じ数の細胞を得るために、バイオリアクターの容積要件を劇的に減少させる（シリーズIIIパートBでさらに議論される）。異なるバイオリアクターシステムで達成可能な密度の範囲は大きく異なることができ、企業がそのスケールアップで取る選択を決定する可能性があります。表1は、異なるバイオリアクターシステムで達成可能ないくつかの範囲と理論的な密度を示している。

まとめると、バイオプロセシングのスケールアップ戦略は、培養肉生産が大量市場に到達するために克服すべき最も実質的な技術的・工学的ハードルの一つである。生物学的製剤や細胞治療の分野における既存の戦略を経験的に検証したり、新種や細胞型の培養肉生産に転用したりするには、かなりの時間がかかるかもしれませんが、過去数十年間の生物処理の驚異的な進化は、成功へのロードマップを提供してくれます。生物製剤、細胞治療、バイオリアクター、培養肉の各分野におけるアイデアや新技術を共有することで、これらの分野での相乗効果が期待できます。

表1。異なるバイオリアクターの種類を使用して記録された細胞密度の範囲のスナップショット。このリストは、網羅的であることを意図したものではなく、達成可能な密度は、細胞の種類、種、および培養条件に応じて変更することができます。

処理のタイムライン

培養肉の生産の一般的なタイムラインは数週間程度であるが、これは細胞の種類、種、バイオプロセスの設計や培養条件、下流の目的とする製品によっ て大きく異なる。例えば、ある種の発生のタイムラインは一般的にin vitroで再現されており、マウスの多能性幹細胞から指示された分化を経て得られた骨格筋は2週間で生産できるのに対し、ヒトのシステムでは3週間以上かかる(Chal and Pourquié 2017)。したがって、異なる種からの同じ細胞型の倍化時間は異なる可能性がある(Cheng et al. 2014)。公表された研究の要約によると、懸濁培養で増殖させたマウス多能性幹細胞の倍化時間は約20時間であったのに対し、ヒト多能性幹細胞の倍化時間は約60〜80時間であった。ヒト多能性幹細胞の細胞培養培地製剤を、着床前胚に類似し、マウス多能性幹細胞に固有の幹細胞状態を表す用語であるナイーブ状態に似せて調整することで、ヒト多能性幹細胞の倍化時間は約30時間にまで減少した（図9、Lipsitz et al. 2019)。別の研究では、胚性線維芽細胞のフィーダー層上で成長したマウス胚性幹細胞は、12〜16時間の倍化時間を示したのに対し、同じ細胞の胚性幹細胞株は、懸濁液中で成長した場合、〜30時間の倍化時間を有していた(Tamm, Pijuan Galitó, and Annerén 2013)。種内の異なる細胞タイプの倍加時間も異なる場合があります。例えば、マウス成体筋芽細胞は、〜24時間の倍化時間を表示する(Shahini et al. 2018)。このように、培地および増殖条件は、細胞株の観察された倍化時間に劇的に影響を与えることができ、特定の数の細胞を生産するための大きなタイムライン効率向上は、種の選択、開始細胞タイプ、および増殖条件の操作のみで付与されることがある。

図9. ヒトおよびマウスの多能性幹細胞の懸濁液ベースの培養に関する文献からの倍加時間の要約。各ドットは別の研究で記録された倍加時間を表している。ヒト多能性幹細胞の倍数化時間は、幹細胞の状態と固有の特性を変化させ る培地（「4i」）で細胞を培養することで短縮することができる。 (Lipsitz et al. 2019).

より大きな動物における細胞サイズ(Han et al. 2013) のような他の変数もまた、総組織質量（図11）の点でより遅い倍化時間を補うかもしれないin vitroで再現されている。成熟時間（シリーズIIIで議論されている）もまた、異なるテクスチャー要件を有するタイムラインおよび最終製品に影響を与える可能性がある。このように、バイオプロセスの経済モデルは、バイオプロセス全体を通して各種ごとに提示される様々な 変数を考慮に入れるべきであり、その多くは培養肉に関連する多くの種について厳密な文献が不足しているため、 経験的に決定される必要があるだろう。

図10 筋管の大きさや発達のタイムラインなど、動物の生理学の多くの特徴がin vitroで再現されている。左から右へ：ウシの筋管、七面鳥の筋管、豚の筋管。画像クレジット：Jess Krieger Source.

スケールアウトとスケールアップ

細胞生産をスケールアップする際の課題を考えると、スケールアウトのアプローチは、培養された食肉を消費者の口に届けるためのより迅速なルートを生み出す可能性があります。このシナリオでは、生産は小規模で行われ、農場や大規模な屠殺場よりもむしろレストランや精肉店に近い食肉生産の要件を満たしている。これらのスケールは、地域の需要に到達するために100〜1000Lの容量のより管理しやすいバイオリアクターのサイズを必要とすると推定されている。したがって、より高い自動化の可能性、より低いエネルギー、土地、および資本支出の要件、および大規模なスケールアップの課題を回避することから時間とお金を節約したスケールアウト施設を設計することが大幅に容易になる可能性があります。同様の戦略は、複数のグループが家庭内キットを開発するなど、さらに小規模なスケールでも構想されている。このように、スケールアウトのアプローチは、培養肉製品の市場への短期的な道筋をより合理的に提供する可能性があり、この戦略の探究が奨励されるべきである。しかし、このような規模での生産量では、後の段階での指数関数的な成長を利用することができないため、世界の食肉消費に対する大規模な需要を満たすことができない可能性が高い。したがって、長期的にこれらの需要を満たすためには、ローカルなスケールアウトと大規模なスケールアップの共存システムが必要になるかもしれない。

非セルラーの考察とセンサシステム

バイオリアクター内の液相中に懸濁され、気相によって気化された細胞（固相）の間の相互作用は複雑であり、バイオプロセスが最適に動作していることを確実にするために高度なモニタリングを必要とします。一般的に、これらの相互作用変数は、物理的（例：温度）、化学的（例：pH）、生物学的（例：細胞濃度）に分けることができます。これらの変数を測定するセンサーは、バイオリアクター自体の内部（インライン）、バイオリアクターの外部（アットラインまたはオフライン）、または継続的に動作する（オンライン）(Biechele et al. 2015)にあることができます。インラインセンサーは、バイオリアクター自体と同じ温度と滅菌プロセスに耐え、成分の溶出を最小限に抑え、再校正を必要とせずに一度に何週間も稼働する可能性があることが必要である。バイオリアクター内に不均一性がある場合は、精度を達成するために複数のインラインセンサーまたはセンサーアレイの使用が必要になる場合があります。一方、オフラインサンプリングでは、より時間に敏感な変数に影響を与え、汚染物質（後述）を導入する可能性がある手動の人間の関与とサンプル操作を必要とする可能性があります。一般的に、現在のセンサー開発はリアルタイムのオンラインモニタリングシステムに焦点を当てていますが、これは高度な分光システムや他の産業での連続的なバイオプロセスの推進によって頻繁に可能になりつつあります。これらのセンサーは、主に FDA のプロセス分析技術ガイドラインに準拠するために開発されていますが、養殖食肉産業でも採用することができます。培養肉のバイオプロセスに影響を与える主な変数は、温度、酸素、二酸化炭素、pH、グルコース、バイオマス、代謝物です。これらの変数とそのセンシングシステムについては、以下で独立して議論する。

培養肉バイオプロセスの温度は、関心のある種に依存する。例えば、ほとんどの哺乳類細胞は37℃前後で培養されているが、昆虫、魚、および他の海洋生物細胞は、かなり低い温度で培養されてもよい(Rubio et al. 2019, Rubio et al. 2019)。それにもかかわらず、プロセス中に正確な温度を記録し、維持することは、多くのパラメータにとって極めて重要である。これは、典型的には、安定した非反応性の白金ワイヤーの片を含む白金抵抗温度計を使用することによって行われる。ワイヤの電気抵抗は温度とともに直線的に増加するため、ワイヤに電流を流すことによって温度を推測することができる(O’Mara et al. 2018)。

溶存酸素の量の約45倍の血液対細胞培養培地によって運ばれることができるように、酸素は、しばしばバイオリアクター内の速度制限基質である(Martin and Vermette 2005)。酸素は、酸素利用率と呼ばれる細胞の代謝需要を満たすために、溶存酸素の形で継続的に供給されなければならない。特定の細胞株の酸素利用率を満たすためには、混合速度、気泡の大きさ、温度、流速、細胞培養液の一般的な特性など、酸素の質量移動係数（kLa）に影響を与える考慮が必要である。 したがって、魚のように、より低い温度で培養された種の細胞は、より低い温度で酸素溶解度が増加するため、異なる酸素要求量を必要とすることがある。適切な酸素化（通常、空気飽和度の３０〜４０％）がない場合、または過剰な酸素化がある場合、細胞の増殖および生存率は急速に悪影響を受ける可能性がある。液相溶存酸素をモニタリングするためのいくつかの方法が存在するが、膜で覆われたアンペロメトリック電極、光学センサ、および常磁性センサは、生物学的用途に最も実用的である(Biechele et al. 2015; O’Mara et al. 2018)。

二酸化炭素とpHは、培養肉のバイオプロセスでは密接にリンクしている。バイオプロセスがスケールアップすると、細胞の数と密度が増加し、標準的な動作範囲5〜10％を超える溶存CO2濃度の増加につながる。CO2は、細胞膜を横切って容易に拡散し、細胞内pHを低下させ、細胞代謝、酵素機能、タンパク質フォールディング、および一般的な細胞の健康に影響を与えることができる(Pattison et al. 2000)。CO2濃度を低下させるためには、表面曝気、スパージング、撹拌などの方法がありますが、いずれも表面対体積の制限やせん断応力を考慮してスケールが大きくなると難しくなります(Matsunaga et al. 2009)。CO2は、典型的には、CO2透過性の膜と電極を含むセベリングハウス電極を使用して測定され、CO2が吸収される際に重炭酸塩溶液内で生じるpH変化を記録する。 pHインジケータは、この方法を光センシング方法に適応させるために使用することもできる(Ali et al. 2010)。

細胞培養液のpHは、最適な細胞の健康のために厳密に制御する必要があります（哺乳類細胞の場合は、一般的に7.4±0.4）。酸素とともに、pHは、乳酸や炭酸（水と反応するCO2に続く）などの細胞代謝の酸性副産物が培地中に蓄積し、pHを低下させるため、細胞の成長速度や代謝に関する情報を得ることができます。実際、細胞培養に関連する標準的な赤ピンク色は、特定のpHのしきい値の下で色を調整する溶解pHインジケータフェノールレッドによって引き起こされます（この場合、あなたの目は光学センサです）。同様の指標は、より実用的なｐＨモニタリングのために、光ファイバに取り付けられた固定化基質に使用することができる。光学的方法の限界は、限られたダイナミックレンジ、一部のフルオロフォアの熱不安定性、および高いイオン強度を有する媒体に対する感度を含む(Biechele et al. 2015)。最後に、イオン感応電界効果トランジスタは、イオン（Ｈ＋）濃度の変化に起因する電流変化を測定することによってｐＨを記録することができるが、これらのデバイスは、平行な参照電極を必要とする。

グルコースは、培養肉培養系内の主要な炭素エネルギー源として作用するため、グルコースおよび他の代謝物の積極的なモニタリングは、給餌戦略、最適な細胞密度、および増殖率を通知することができる。指数関数的な細胞増殖中にグルコースとグルタミンが消費されると、培地中で乳酸とアンモニウムがそれぞれ増加し、細胞の増殖と生存率に禁止的な影響を与える可能性があります。これらの副産物の減少または制御を目的としたいくつかの方法が開発されてきたが(Freund and Croughan 2018)、アンモニウムの毒性は乳酸塩（20〜40mM）よりもはるかに強力であり（2〜4mM）、したがって、減少させるためのより重要な標的となり得る(Schneider, Marison, and von Stockar 1996)。グルコースと様々な代謝物は、通常、分光分析によって測定されます（図11）が、いくつかの酵素法も存在します。赤外線、蛍光、ラマン分光法などの生体分子の検出に主に使用される方法は、基本的には、測定された振動運動（赤外線）、振動の散乱（ラマン）、または励起時に放出される光子（蛍光）に基づいて化学的なフィンガープリントを明らかにする分子結合と電磁波の相互作用に依存している。これらのセンサーシステムは、継続的に使用でき、センサーと分析物自体の間に相互作用がなく、多重化できるという利点があります。

図11 バイオプロセスの様々な代謝物や特性を分光法でモニターすることができます。 From Biechele et al. 2015.

赤外分光法は、近赤外波長（740–1300 nm）と中間赤外波長（1300–15000 nm）が含まれている。それぞれ、グルコースおよび乳酸などの関連する有機分子を検出することができるが、特定の波長は、特定の化学結合構造を含む分子に対してより有用である(Biechele et al. 2015)。中赤外波長を使用すると、これらの目的のために、より強い信号とより高い分解能を得ることができる。ラマン分光法は、典型的には可視または近赤外領域の電磁波に依存し、赤外法を補完することができる。一般に、分光法の実施は、関心のある分子の比較的低い濃度、存在する分子の多様性、生きた細胞培養物内での条件の変化による較正の困難さ、および生成される大量のデータのために困難であり得る(Zhao et al. 2015)。したがって、関心のある個々の分子を高い信頼性で同定することを可能にするケモメトリック統計学的手法を適用するためには、パイロット研究またはスパイクイン研究からの大規模なトレーニングデータのセットが必要とされるかもしれない。ケモメトリック分析からのデータ駆動モデルは、次に、カスタムセルベースの食肉バイオプロセスのためのソフトセンサー（ソフトウェアベースのアルゴリズムと組み合わされたセンサー）アルゴリズムにフィードすることができる。

同様の分光学的方法は、濁ったサンプルを通る光の散乱または透過に基づいて、細菌汚染物質を含むバイオマス濃度を検出するためにも使用することができる。近赤外波長は、典型的な培地がこれらの波長の光をあまり吸収しないので、より大きな哺乳類細胞には典型的に840〜910 nmの間の特定の波長が使用される(Ahmed et al. 2014)。しかしながら、これらの方法は、細胞の生存率の決定を行わず、細胞培養物内の気泡または他の大きな粒子の影響を受け得る。これらの問題は、２つの電極間の正弦波電場の測定が、漿膜のない気泡のような物体の影響を最小限に抑えるインピーダンスセンサの使用によって部分的に緩和することができる。インピーダンス法は、分光法でなければ失敗する可能性がある固体足場内の細胞密度の測定に適応させることができる（シリーズIIIで説明）。最後に、追加の形態学的、サイズ、または生存率のデータが必要な場合には、in situ顕微鏡法およびフローサイトメトリーもまた、生物処理スキームに組み込むことができる(Biechele et al. 2015)が、培養肉にこれらの方法を実施する実用性は限られているかもしれないが。

遺伝子工学における最近の進歩は、細胞の外因的特性（例えば、せん断応力）または内因的特性（例えば、酸化的損傷）を感知することができる遺伝的にエンコードされたバイオセンサーの設計を可能にしている(Polizzi and Kontoravdi 2015)。基本的に、遺伝的にコード化されたセンサーは、特定の特性に結び付けられた特定の遺伝子の転写に依存する。緑色蛍光タンパク質（GFP）または酵素反応の産物（例えばルシフェラーゼからの光）のような検出可能なレポータータンパク質の発現を駆動するためにこれらの遺伝子プロモーターを使用すると、細胞集団とその環境との相互作用についての重要な洞察を提供することができる。いくつかの例としては、グルコースまたはアミノ酸飢餓を感知するためのアンフォールドタンパク応答に関与する遺伝子(Kaufman et al. 2002)、低酸素応答遺伝子(Liu et al. 2005)、機械的ストレス遺伝子、およびタンパク質産生（すなわち小胞体ストレス応答）遺伝子(Du et al. 2013)などが挙げられる。最適化された細胞株にバイオセンサーを構築することは、コストの節約、較正、滅菌、時間感度、および柔軟性を含む、前述の方法よりもいくつかの利点を提供する可能性がある。しかし、構成的に活性なバイオセンサーからの阻害性代謝負荷を考慮する必要があるだろう。また、これらのトランスジェニックを含有する製品を消費できるかどうかは、まだ規制によって決定されていません。しかしながら、これらのバイオセンサーの多くは、純粋に合成されたものではなく、動物性タンパク質（例えば、A. victoria由来のGFPおよびP. pyralis由来のルシフェラーゼ）に由来するものであるため、FDAによる一般的に安全と認められている（GRAS）指定を受けることは、克服できないことではないかもしれない。

オートメーション

バイオプロセスに自動化を組み込むことで、手作業の労働時間、試薬の使用、実験室のスペース、およびバッチ間のばらつきを制限し、品質管理を標準化することで得られる一般的な利益について、大幅なコスト削減を実現することができます。また、自動化は、クローズドシステムに実装された場合、汚染の防止と規制遵守を容易にすることができます。自動化は、細胞治療や再生医療の分野では、まだ始まったばかりです。現在では、脂肪組織生検からの脂肪由来幹細胞の治療用量のクローズドエンドツーエンド製造を可能にする製品がいくつか存在しており(Fraser et al. 2014) 。これらの進歩にもかかわらず、培養肉の製造は、基本的には桁違いの細胞数を必要とするため、特に細胞のスケーリング、品質管理、収穫（シリーズVで議論されている）、および製品の処方（シリーズVで議論されている）に関して、大幅な工学的なカスタマイズが必要となる可能性があります。これらのカスタマイズは多額の資本支出を必要とする可能性があるため、新興企業の内部ではなく、既存のライフサイエンス企業や技術関係者からハードウェアやソフトウェアを提供することで構築するのが適しているかもしれない。既存の少量生産のバイオプロセス産業や、自動化が豊富な大量生産の食品・農業技術産業からの学びを応用することは、 養殖食肉生産への導入に有利であるかもしれない。

一般的に、自動化は、高度に手動化されたステップを遡及的に置き換えるのではなく、製造プロセスに一から導入するように設計されるべきである(Ball et al. 2018)。種または製品の特異性は、カスタム実装を指示するかもしれないが、本シリーズを通して記載されているような一般的なバイオプロセスは、保存される可能性が高い。したがって、重要なプロセスパラメータの特定及び自動化の実施を導くための分析フレームワークの構成に向けた 業界全体の協力は、業界全体に配当をもたらすであろう。同様に、これらのパラメータは、ソフトウェア（オープンソース）、センサシステムまたは他のハードウェアコンポーネント、および安全性と規制上の考慮事項にまたがる業界の標準化の指針となる可能性があるが、知的財産開発の可能性を犠牲にすることは考慮する必要があるだろう。また、培養肉の商品原価（COGS）モデルを確立し、そこからバイオプロセス内の高コスト領域やボトルネックを特定し、自動化や工学的最適化のために優先順位をつけることができるようにするための共同作業も必要とされている。この業界の発展途上にあるため、いくつかの重要なプロセスパラメータをよりよく定義する必要があることが明らかになるかもしれないが、従来の動物用食肉と同等の価格を達成するために、業界全体での最終的な自動化が追求される可能性が高い。

滅菌

学術的な細胞培養ラボでは、数人の個人がインキュベーターのドアを開閉し、細胞の入った容器を持って外気を自由に歩くことを伴うかもしれませんが、工業化されたバイオプロセスは、大部分が外界から封鎖されている。以前に議論された単一使用のバイオリアクターシステムにかかわらず、製品、生産時間、または除染のコストの損失を発生させないように、他の生物学的処理産業における規制および安全性のガイドラインへの準拠を確実にするために、予防的な制御および汚染の監視方法を開発するために大きな努力を捧げてきた。これらの管理およびベストプラクティスの多くは、養殖食肉産業にも適用できるはずである。

図12。バイオリアクターへの気体と液体の供給のろ過と窒素ガスを介した正の内圧の維持によって維持される無菌境界の概要。 Image found here.

最も一般的な汚染の形態は、細菌（マイコプラズマなど）、真菌、ウイルス、または細胞間の交差汚染などの不定因によるものであり、伝 播性海綿状脳症(Piccardo et al. 2011) についてはいくつかの懸念がある。 また、バンクに保管されている細胞株は、業界で標準的に行われているように、凍結保存される前に、すでに不定菌の汚染についてのスクリーニングが行われていることも知っておくべきである。このように、バイオプロセス中にバイオリアクターに侵入する不定菌を防止し、堅牢なモニタリングシステムを持つことは、製品の安全性を確保することになります。

前述したように、細菌汚染を検出するための分光センサーは、特定の汚染物質または外国の不定菌を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応または免疫学に基づくアッセイ（例えばELISA）などの他の方法と同様に利用することができる。無菌が理想的であるが、許容可能な非悪質汚染（例えば、許容可能な低レベルまたは性質上の非病原性）が発生する可能性があり、汚染事象のリスクが常に存在する。抗生物質および抗真菌剤は、治療および予防の両方に使用することができるが、遺伝子発現の変動(Ryu et al. 2017)、増殖(Cohen et al. 2006)、および分化(Y. Chang, Goldberg, and Caplan 2006)につながる可能性がある。最も重要なことは、無菌技術の適切な実践、予防的コントロールの実施（以下で議論される）、および滅菌戦略は、細胞培養培地における抗生物質および／または抗真菌剤の使用を不要にすることである。そのため、それらは培養肉のバイオプロセスには含まれない（シリーズIV、パートCでさらに議論される）。無菌表面を維持するために抗菌剤が使用される可能性がある。

バイオリアクターの異なる構成要素は、様々な汚染物質の侵入の影響を受けやすく、従って、無菌境界を維持する侵入防止障壁を必要とする（図１２）。ガスまたは媒体の入口および出口については、サイズ排除を介して潜在的な汚染物質を捕捉するために、様々な膜またはフィルターを使用することができます。例えば、0.22または0.1 µmの細孔サイズのフィルターは、ガスや液体の安定した流れを可能にしますが、バクテリアのような小さな細胞の通過を防ぎます。より小さな細孔サイズのフィルター（例えば20nm）もウイルスの保持のために存在します。培地用フィルターは、主に、蒸気滅菌（後述）が培地中の熱に敏感な成分に損傷を与える可能性がある場合に使用される。 ガス用フィルターは、水性エアロゾルの通過を防止するために、ＰＴＦＥなどの疎水性膜で作られているのが一般的である。これらのフィルターおよび他の接続部分は、設置時に汚染物質がないことを確認するために、ガンマ線照射またはオートクレーブ滅菌が可能な材料で作られているのが一般的である。細胞の透過性を引き起こすパルス電場のような食品産業で使用される他の形態の滅菌は、細胞培養培地の細菌および細菌胞子汚染の防止のために適応され得る(Reineke et al. 2015)。さらに、フラッシュ低温殺菌としても知られる高温短時間殺菌は、ウイルスを不活化するために使用することができるが、同様に、熱に敏感な成分に何らかの脅威をもたらす。

フィルタリングや放射線を利用した滅菌方法に加えて、蒸気を利用した熱滅菌は、ステンレス製の撹拌タンクリアクターを使用したバイオファーマで最も一般的に使用されている方法です。熱滅菌は、容器やプロセスコンポーネントの洗浄後に行われることが多く、高圧水ジェットで機器を洗浄し、アルカリ性および酸性溶液で洗浄し、乾燥させるクリーンインプレースガイドラインに準拠している。蒸気滅菌は、入口と出口で直接、空の容器内で、容器内の媒体で、または連続的なプロセスラインを流れる媒体で行うことができます。生物処理ライン全体を通して上流および下流の両方で実施される場合、この行為は、スチームインプレースと呼ばれます。耐熱性細菌B. stearothermophilusの死滅速度を測定することによって推定される蒸気滅菌パラメータは、時間、温度、水分（すなわち飽和蒸気）、蒸気の直接接触、空気除去、および乾燥を含む多くの変数に依存する。加熱および冷却の要件および時間の違いは、規模および他のプロセス変数によって異なる場合があります。必要とされる高温（通常は121℃以上）のため、これらの変数は、規模での培養肉施設の総エネルギー需要に影響を与え、その二酸化炭素排出量に影響を与える可能性があります。そのため、これらの負の外部性を部分的に回避するために、代替のバイオリアクターのタイプが追求されることがあります。滅菌が達成されると、バイオリアクターは、汚染物質の侵入を防ぐために、典型的には不活性窒素ガスの形で、正圧下で動作します。汚染が検出された場合は、ソースへの調査（例えば、欠陥のあるフィルター、マイクロクラック、不適切なシール）が実行され、コンポーネントが洗浄され、再滅菌されている。

次回のディスカッションシリーズでは、培養肉のバイオエンジニアリングに関する考察に焦点を当てる。

Cultivated Meat Science Discussion Series III: Bioengineering, part A

序章

市場に出回っている食肉製品は、構造的に洗練されたものが多い。その一端には、すり身やホットドッグのような高度な加工品、中間にはハンバーガーやソーセージのようなひき肉、そしてもう一端にはヒレやステーキがあります。より洗練された製品を再現するためには、肉の複雑な多細胞構造を再現するために、組織工学、再生医療、生体材料科学の技術を借りて改良する必要がある。以下に、バイオエンジニアリング生物学の中核となる生物学、足場形成技術、および複雑な構造を作り出すために考慮すべき方法のレビューを紹介する。

細胞外マトリックスとメカノトランスダクション

シリーズⅠ、シリーズⅡで述べたように、幹細胞の初期増殖は、培養肉の生産プロセスには欠かせないものです。何兆個もの幹細胞がどのようにして分化を経て構造化された肉になるのでしょうか？それを理解するためには、細胞外マトリックスとメカノトランスダクションの背景が必要です。

生体内では、細胞は細胞外マトリックス（ECM）と呼ばれる分泌されるタンパク質とプロテオグリカンの複雑なマトリックスの中に存在している。ECMには固有の硬さがあり、インテグリンと呼ばれる特殊な細胞膜タンパク質を介して細胞の活動に影響を与えます。インテグリンは、下流のエフェクタータンパク質を媒介するメカノセンサーとして作用し、アクトミオシン細胞骨格と細胞外マトリックスを接続する局所接着複合体の形成につながる。インテグリンが媒介する局所接着は、ECMと細胞の内部細胞骨格との間の綱引きの中間点と考えることができます。これらの接続は、集合的に細胞外環境を感知する細胞の能力を媒介し、細胞の極性、遊走、および分化に影響を与えることができる下流のシグナル伝達を導く(Handorf et al., 2015; Sun et al., 2016)。全体として、このプロセスはメカノトランスダクションと呼ばれています（図1）。

図1. 細胞は、細胞の行動に影響を与えることができる多くのタイプの力にさらされることができます（A）。焦点接着複合体（B）は、細胞外環境を感知する細胞の能力を媒介している。インテグリンは、細胞外マトリックスから細胞内アクトミオシン細胞骨格への情報の主要な伝達者として機能します。この情報は、メカノトランスダクションシグナル伝達経路を介して伝達され、下流の細胞応答の範囲に影響を与えます。 From McMurray et al, 2015.

胚発生と発生の間に、細胞は細胞外環境からの合図を介して一部で増殖し、専門化（すなわち分化）する。この間、原始筋の形成、胃形成、組織の特殊化などの重要な発生のランドマークを通過する際に、ECM構成要素および細胞自体が活発に運動している(Loganathan et al., 2016)。ECM密度および勾配、組成、および3次元トポグラフィーなどの追加の因子は、細胞の行動に大きな影響を与え得る(Rozario and DeSimone, 2010)。本質的には、細胞が定義されると、その遺伝子発現パターンは、特定のECM成分の生成と分泌を指示し、その結果、細胞の分化と移動をさらに指示するフィードバック機構として作用し、これは「動的互恵性」と呼ばれるプロセスである(Bissell et al., 1982)。初期胚の構成要素はすべて幹細胞であるため、幹細胞は ECM の合図に非常に敏感であることを意味している。実際、成体における幹細胞の調節および維持は、幹細胞のニッチを構成するECM成分に大きく依存しており、各組織のニッチは典型的には固有のECM成分のセットを含んでいる(Gattazzo et al., 2014)。

過去20年以上にわたり、多くの研究が、培養肉生産に関連するすべての細胞タイプ（多能性幹細胞(Wang et al., 2015)、間葉系幹細胞(Engler et al., 2006)、サテライト細胞(Calve et al., 2010)、および脂肪原性幹細胞(Guneta et al., 2016) における幹細胞性および分化の調節におけるECMの重要な役割を実証してきた。特定の幹細胞ニッチ微小環境のECMの硬さとタンパク質組成をin vitroで模倣することにより、幹細胞を予測可能な系統に誘導することができる。この生物学は、細胞培養培地組成物の変化（シリーズIVで議論されている）と一緒に、構造化された3D培養肉製品の将来の創造を促進するのに役立つであろう。

マイクロキャリア

増殖期には、接着依存性幹細胞をバイオリアクターで大規模に増殖させる必要がある。シリーズIIで議論されているように、この非ネイティブな環境は、細胞が懸濁液の成長に適応していない場合、スフェロイドとして成長し、またはそうでなければ、Rhoキナーゼ（ROCK）阻害剤のような小さな分子を介して接着独立性に騙されている場合、アノイキスにつながる可能性があります。懸濁液ベースのバイオリアクターにおけるアノイキスの活性化をバイパスするために一般的に使用される1つの方法は、マイクロキャリアの使用を介している。マイクロキャリアは、典型的には直径１００〜４００μｍ（より大きくすることができる）の小さなビーズ状構造体であり、これは、剛性、トポグラフィー、および多孔性などのＥＣＭ特性の模倣を介した細胞の付着を可能にする（後述、McKee and Chaudhry, 2017; Rafiq et al., 2013)。マイクロキャリアは、体積比に対する大きな表面積を提供し、２Ｄ培養と比較して細胞の高い密度を可能にし、柔軟性（例えば、バッチ、フェッドバッチ、灌流）および制御可能なバイオプロセシングパイプラインで使用することができるので、バイオリアクター培養において有利である。マイクロキャリアを用いた細胞の拡張は、細胞がビーズ間移動を受けるより多くのマイクロキャリアの追加によって(Verbruggen et al., 2018)、または酵素解離およびシードトレインプロセスを介したより大きな容器への細胞の通過によって(Oh et al., 2009; Rafiq et al., 2013)、比較的容易である。さらに、分化は、媒体成分、マイクロキャリア特性、またはメカノトランスダクションを介したせん断力の変化によって引き金となって(Jossen et al., 2014)、マイクロキャリア自体上で起こり得る(Park et al., 2014; Torgan et al., 2000)。このように、マイクロキャリアは、関連する幹細胞集団のスケーリングや、ここまで述べてきたバイオエンジニアリングの原理を活用した培養肉生産のための分化した細胞タイプの提供において、非常に大きな可能性を提供している。

図2. マイクロキャリアのトポグラフィーは、せん断応力、細胞の整列と極性、およびバイオリアクター内のマイクロキャリアの挙動から細胞を遮蔽するのを支援するために設計することができます。 From Wu et al., 2018.

マイクロキャリアは、バイオプロセスの最適化のために様々な方法で変更することができる。例えば、マイクロキャリアのトポグラフィーは、せん断応力を防止するためのヌック、および細胞の整列および極性を支援するためのパターン化されたトポグラフィーで設計することができる（図２、Wu et al., 2018)。マイクロキャリアの比重は、より高密度で重いマイクロキャリアが懸濁培養で維持するためにより多くの電力を必要とするため、バイオリアクター内での性能に影響を与えることができ、その結果、細胞が受けるせん断力の量に影響を与えることができます。それらは、典型的には、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、またはデキストランのような材料から作られるが、他の植物由来の生体材料（後述）、または化学的、機械的、または生物学的に酵素的に溶解または分解することができる材料から作ることもできる(Rodrigues et al., 2019)。分解方法は、選択された場合、細胞増殖またはバイオプロセスパラメータと迅速で互換性のあるものでなければならず、いくつかの材料および候補方法が存在するが、より多くの最適化が必要である(Bodiou et al., 2020)。マイクロキャリアは、それ自体は、しばしば、ECMタンパク質でコーティングされ、正電荷を与えられ、または細胞の付着を補助するために、より親水性になるように化学的に改変される(Bodiou et al., 2020)。ECMタンパク質にコンジュゲートされた熱応答性ナノブリッジのような、マイクロキャリアと同様の細胞拡張の役割を果たす他の戦略が存在する(Harkness et al., 2019)。これらは、制御されたサイズの凝集体での細胞の成長を可能にし、これらは、後で解離され、温度誘起分解および再集合に続く周期的な性質でパサージュすることができる。この戦略は、迅速かつ可逆的な分解の可能性を提供するだけでなく、酸素および栄養の利用可能性の欠如に起因する大規模な細胞凝集体の壊死性コアに関連する問題を回避することができます。熱可逆性または犠牲的な生体材料（後述）は、したがって、より実用的なスケールアップソリューションをもたらす可能性があります。

培養肉での使用のためのマイクロキャリアのさらなる最適化がまだ必要である。例えば、使用される細胞タイプの範囲（シリーズIで議論されている）と種のために普遍的なマイクロキャリアを開発することができる可能性は低い。市販のマイクロキャリアは、培養肉用に設計されていないため、新規なバイオリアクターの設計を作成するのと同様に、新規なエンジニアリングが必要になる可能性があります。また、付着および成長に影響を与えうる播種密度は、各細胞タイプおよびマイクロキャリアペアに対して最適化する必要があるだろう(Bodiou et al., 2020)。

しかしながら、マイクロキャリアの使用に関する決定は、意図された製品とのバランスをとる必要があり、これは、マイクロキャリアが増殖のために一時的に使用されるか、処理中に分解または溶解されるか、または食用にされて最終製品に組み込まれるかどうかに影響を及ぼす可能性がある(Bodiou et al., 2020)。マイクロキャリアは、シリーズＶのハーベスティングのセクションでさらに議論されるであろう。

足場生体材料

構造化された厚さのある肉製品を製造するためには、細胞を足場に移す必要があります。足場は理想的には、細胞を特定の方法で付着、分化、成熟させ、肉の3Dサイトアーキテクチャーを模倣しながら、培地の連続的な灌流を可能にし、実際の組織の血管化（後述）に類似した方法で細胞の付着、分化、成熟を可能にします。したがって、足場の空隙率、機械的特性、および生体適合性に関する考慮が最も重要である。場合によっては、食用マイクロキャリア上での分化細胞の生産 (Marga et al., 2017、または後述の他の方法）は、様々な非構造化製品（シリーズＶで議論されている）におけるブレンドされた添加物として包含するために選択され得る。しかしながら、従来の動物の肉を完全に置き換えるには、ステーキのような構造化製品の複製が必要であり、これらの用途のための方法を構築するために、組織工学者、材料科学技術者、および他の学際的な科学者のスキルを必要とする。

足場を構成する生体材料は、その下流の特性の多くを左右する。生体材料には、大きく分けて天然材料、合成材料、天然材料と合成材料の複合材料がある。天然生体材料には、フィブリン、ラミニン、ヒアルロン酸、ゼラチン（すなわち加水分解コラーゲン）、ビトロネクチン、またはマトリゲルなどのECMミックスなど、脊椎動物の固有のECMを構成するものが含まれます。追加の天然生体材料の例としては、アルギン酸（藻類からの）、アガロースおよびカラギーナン（海藻からの）、シルク（クモからの、Johansson et al., 2018)、キトサン（甲殻類、酵母、または真菌からの）、セルロース（多くの植物からの）、脱細胞化された植物または動物組織（後述）、および真菌類の菌糸体（キトサン、コラーゲン、およびセルロースは、CampuzanoおよびPellingでレビューされている。2020; Brodwin, 2018).。) これらの天然生体材料は、一般に、高い生体適合性、高い分解性、および低い免疫原性を有するという点で有利である；しかしながら、脊椎動物ECMに由来する生体材料のみが、ネイティブな細胞接着モチーフを介して機能化されている。アルギン酸やキトサンなどの生体材料上で細胞を増殖させることは可能であるが、細胞の接着や移動を促進する認識モチーフを欠いており、機能性が制限されている。これらの細胞認識モチーフには、フィブロネクチンおよびラミニンにおける対応するアミノ酸配列にそれぞれ由来する、あまり一般的ではない他のモチーフの中でも、Arg-Gly-Asp（RGD）およびIle-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV、(Tashiro et al., 1989) ）モチーフが含まれる(Bajaj et al., 2014)。細胞表面上のインテグリンは、これらのモチーフの結合受容体として機能し、細胞接着および下流のシグナル伝達を媒介する(Xiong et al., 2002)。ゼラチンなどの他の機能性生体材料との混合(Enrione et al., 2017)、RGDペプチドとの化学的架橋(Tsai et al., 2013)、またはRGDモチーフを直接生体材料に遺伝子工学的に工学する(Lee et al., 2016; Widhe et al., 2016) のいずれかによって、RGD非含有生体材料の機能化を可能にする多くの戦略が存在する。イオンビーム蒸着またはプラズマ処理などの表面機能化方法もまた、親水性などの好ましい表面特性を作り出すために使用することができる(Rana et al., 2017)。あるいは、合成生体材料を使用することもできる。合成生体材料は、様々な所望の生物物理学的特性に対する高いチューナビリティを可能にし、組織工学目的のために魅力的なものにする(Tibbitt and Anseth, 2009; Zhu and Marchant, 2011)。合成生体材料の一般的な例としては、プルロニック、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（２-ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、およびポリ（アクリルアミド）が挙げられる(Rosales and Anseth, 2016).。しかしながら、これらの材料は細胞接着を支持しないので、それらはまた、以前に記載されたように機能化される必要があり、複合材料を形成するために他の天然ポリマーと組み合わせられるのが一般的である。特筆すべきことに、ＲＧＤペプチドは、食品での使用がまだ承認されておらず、これは、培養肉用途での使用を妨げる可能性がある。

ハイドロゲル

精製されたＥＣＭタンパク質は、２次元細胞増殖のための基質を被覆するために使用することができるが、３次元培養における単一のタンパク質成分の使用は、機械的特性、メッシュネットワークのサイズ、および分解などの望ましい属性の欠如をもたらすことが多い（Caliari and Burdick 2016) 。したがって、合成生体材料および天然生体材料からなる複合ハイドロゲルを作製することにより、以下で議論するこれらの特性を制御することに大きな努力が払われてきた。

図3. ハイドロゲルは、様々な異なる細孔サイズと生体適合性の特徴を含むことができます。A）では、脂肪由来の幹細胞が走査型電子顕微鏡下でイメージ化され、細胞接着を助けるRGDペプチドを含まないN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)ヒドロゲル内で見られます。B）では、足場への細胞接着を助けるRGDペプチドが添加されている。From Golunova et al., 2015.

組織工学における応用生体材料の使用の大部分は、ハイドロゲルの形である（図３）。ハイドロゲルはポリマー鎖の3次元ネットワークであり、その親水性のために容易に水を吸収することができます（乾燥重量の1000倍まで）。それらは、様々な外部刺激（例えば、温度、光、pH、電場）に応答して膨潤または脱膨潤するように設計することができ、様々な高分子の組み込みのために調整することができます（Ahmed, 2015; Bajaj et al., 2014）。その水性構造のため、ヒドロゲルは、当然のことながら、酸素に対する高い透過性を有し、水溶性分子の流れを可能にし、身体の軟組織を絶妙に模倣している。

ハイドロゲルの機械的特性は、原子間力顕微鏡を用いて測定され、応力やひずみに対する材料の剛性を定義するヤング率を明らかにすることがよくあります。生体内では、異なる組織タイプのヤング率は可変であり、これはメカノトランスダクションを介して細胞の運命を決定するのに役立ちます。例えば、脂肪組織および脳は軟らかい（〜0.2〜1.0kPa）、骨格筋は中間的な（〜10kPa）、骨は硬い（〜30〜45kPa）組織である。 このように、足場内でこれらの硬さを再認識することは、幹細胞の分化を指示することができる。例えば、間葉系幹細胞が軟質または硬質のハイドロゲル上で成長すると、それぞれ脂肪または骨への運命を偏らせることができる(Engler et al., 2006; Guvendiren and Burdick, 2012)。同様に、筋サテライト細胞は、その本来の幹細胞のニッチの硬さに一致する基質中で成長すると、自己複製することができる(Gilbert et al., 2010; Safaee et al., 2017)。剛性のチューニングは、架橋の増加（図４）、カーボンナノチューブ(Shin et al., 2012)、グラフェン(Martín et al., 2017)、DNA(Chen and Seelig, 2019)の添加、または光架橋可能な側部基を有する天然または合成ポリマー材料の修飾によって達成され得る。重要なことに、これらの光架橋可能な基は、高速重合を可能にし、バイオプリンティング（後述）のようなプロセス中に細胞のカプセル化を可能にする。培養肉足場は、このようにして、所望の肉製品に見られる脂肪、筋肉、および結合組織のアーキテクチャを複製するために、予めパターン化された空間配向で剛性を規定する様々な複合ポリマー材料で構築され得る。実際、研究では、単一のヒドロゲル内の剛性特性を介して、幹細胞の骨および脂肪への運命の偏りが実証されている(Freeman and Kelly, 2017)。あるいは、ヒドロゲル自体は、細胞培地および細胞の混合物に溶解し、細胞の付着および拡散を補助することができる。モサミートは、細胞の分化または構造化のために専用の装置内に細胞を配置するために、細胞を充填した溶解したヒドロゲルの使用を記載している(Breemhaar and Post, 2019)。

図4. ハイドロゲルは、モノマーの化学的性質に基づいた様々な方法で架橋することができます。さまざまな化学的性質を利用することで、剛性、トポグラフィー、生分解性、成長因子などの可溶性分子の取り込みなど、ECMの特性を模倣することができます。 From Bi and Liang, 2016.

ハイドロゲルは軟組織を模倣することができるが、その規模には限界がある。生体内で血管化した組織に類似した方法で、酸素の拡散や栄養素や老廃物の輸送を可能にする厚い組織を作ることは、挑戦的であり、活発な研究分野となっている。一般的に、移植に使用される足場には、体内に入った後の組織の新生血管化を可能にする気孔が含まれている(Bramfeldt et al., 2010)。しかしながら、培養肉用の足場は、現在の技術の状態では、幹細胞から血管組織を作成する方法が理解され始めたばかりであるため(Wimmer et al., 2019)、in situ血管化ではなく、バイオリアクター内での灌流（後述）を介した細胞生存性のサポートを目的とする場合がある。これは、足場の網目状の細孔ネットワークは、理想的には、細胞が足場に浸潤し、栄養アクセスの２００μｍ以内に横たわることができるように、相互に接続され、分散されているべきであることを意味し、これは酸素の質量移動の上限である(Martin and Vermette, 2005)。細孔の形状、体積、および粗さなどの他のパラメータも考慮する必要がある(El-Sherbiny and Yacoub, 2013)。理想的には、ＥＣＭの再捕捉は、構造的ＥＣＭ構成要素自体のスケール（すなわち、直径50~500nm、(Barnes et al., 2007)）で起こるべきであり、一方、足場の気孔率は、細胞の浸潤および移動を可能にするために、マイクロメートルスケールであるべきである。この一般的な原理を模倣することは困難であった。しかし、これらの特性を有する大規模なハイドロゲル足場を作製するための洗練された技術が完成しつつある（シリーズIII、パートBで議論されている）。最後に、消費のために作られた組織が体内で機能的である必要がないことを考えると、人口密度が低く、下流の感覚特性によって組織化されるように設計された足場の方が、より簡単に達成できるかもしれない。いったん人口化されると、構造体は、収穫時に圧縮されるか、または最終製品へとさらに構造化され得る（シリーズVで議論される）。

慎重な設計上の考慮は、組織工学において、生物学的に不活性な副産物を有する非免疫原性の生分解性材料を利用するためになされてきた（それらは、再生医療目的で体内に挿入されることを意図しているので(Bajaj et al., 2014)。同様に、不活性副産物に生分解する足場は、非可食性材料が最終製品に組み込まれるのを避けるためだけでなく、細胞がヒドロゲル足場をそれ自身のネイティブECMで置き換えることを可能にすることによっても、培養肉に望ましいであろう。実際に、ハイドロゲルは典型的には静的な基質であり、それだけでは細胞とECMの間の時空間相互作用を動的に再現することができない。これを克服する一つの方法は、タンパク質分解性クロスリンクを組み込むことである(Khetan et al., 2013; Patterson and Hubbell, 2010)。これは、マトリックスメタロプロテアーゼのような自然に分泌される酵素がヒドロゲル基質を分解することを可能にし、細胞の移動および以前に説明した動的な相互作用の確立を可能にする。光分解性ポリマー(Kloxin et al., 2009)や光を媒介とした架橋を可能にするユニークな化学物質(Guvendiren and Burdick, 2012) など、他の一連の方法もバイオエンジニアによって開発されており、ECM-細胞のダイナミクスをより正確に再現することができる。

図5. 成長因子やその他の生体分子は、細胞シグナル伝達の空間制御など、ECMの特性を模倣するためにハイドロゲル内に埋め込むことができます。 From Blackwood et al., 2012.

バイオエンジニアはまた、可溶性分泌シグナルの制御された拡散など、ECMの他の特性を模倣することも試みている（図5）。生体内では、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどのECM分子は、局所的な細胞の遊走や分化を調節する成長因子と結合し、隔離することができます。マウス腫瘍細胞に由来するMatrigelのようないくつかのヒドロゲルは、量が可変で、空間的な分布が不明であるにもかかわらず、これらの埋め込まれた成長因子を含んでいる。光消去可能なリンカーを含むタンパク質または光ケージドペプチドの組み込みのような技術は、光を介した封じ込められた因子の正確で、時に可逆的な時空間的放出を可能にする(So et al., 2018)。しかしながら、これらの方法が、スケールでの培養肉生産のためにどの程度の実現可能性があるかは不明である。むしろ、肉の細胞構造を模倣するために空間的に分散されたヒドロゲル足場内の特定の成長因子の共有結合(McCall et al., 2012)は、前駆体幹細胞の足場内の正しい位置に、または下流の最終的に分化した細胞運命に向かって、添付ファイルまたはガイダンスを支援することができるかもしれません。

足場として使用できる天然ポリマーの多くは、ヒトにとっても食用であり、そのうちのいくつかはすでにFDAによって食品への使用が承認されている（規制は地域によって異なる可能性がある）。したがって、マイクロキャリアまたは培養肉開発のための足場に使用される可食性ポリマー材料は、他のいくつかのタイプの材料で必要とされるような、足場から細胞を除去すること（シリーズVで議論されている）や、ヒトの消費に対する安全性を厳密に実証することを避けるために追求される可能性が高い。培養肉用の食用足場を用いたこの方向の研究はすでに始まっている。FDA承認の食用生体材料の例としては、ペクチン(Munarin et al., 2012)、ゼランガム(Gong et al., 2009)、キトサン、ゼラチン、セルロース、グルコマンナン、デンプン、グルテン、およびアルギン酸などが挙げられる(Del Valle et al., 2017)。最近の実証は、テクスチャード大豆タンパク質が、ウシ幹細胞の付着（事前の機能化なしに80％以上の播種効率）および増殖のための実行可能な足場として機能し得ることを示唆している(Ben-Arye et al., 2020)。ＰＥＧのようないくつかの合成ポリマーもまた、ＦＤＡで承認されている。前述したように、これらのポリマーの大部分は、細胞接着のための機能的ドメインを欠いているが、ＲＧＤペプチドで機能化することができ、またはゼラチンのような機能的な食用成分と組み合わせることができる(Enrione et al., 2017)。重要なことに、これらの足場はまた、原料成分の点で手頃な価格であり、スケーラブルである傾向があり、スケールの制限は主に作製方法によって決定される（後述）。組換え酵母やバクテリアを用いたコラーゲンなどのタンパク質の大規模生産を独自に実証している企業もあり、培養肉産業で使用される生体材料の創出のための将来的なプラットフォームとなる可能性がある。最後に、これらのバイオマテリアルの多くは骨の組織工学にも利用されている(Levengood and Zhang, 2014)。

足場はどのように作られているのか？

人間の臓器をゼロから作り上げることを目指して、複雑な組織を再構築するための様々な技術や方法が開発されてきました。一般的に、複雑な組織のバイオファブリケーションには、トップダウン型とボトムアップ型の2つのアプローチが考えられます。トップダウンアプローチでは、一般的に上述したように、足場が作製され、その足場上に細胞が播種されるが、これらのアプローチは一般的に組織の微細構造を再現するのに苦労する(Nichol and Khademhosseini, 2009)。別の方法として、ボトムアップアプローチは、より大きく、より複雑な組織タイプに組み立てることができるように、ミクロスケールでモジュール化された生体構造を作成することを目的としている。3D印刷の進歩は、現在、両方の努力の組み合わせアプローチを可能にしている(Daly and Kelly, 2019; Moroni et al., 2018)。各方法の中心には、以前に議論された問題に対する懸念がある：生体材料の選択、生体適合性、多孔性など。これらの問題を最もよく処理する新興技術、および3Dバイオプリンティング、ポリマー紡糸、脱細胞化、および他の考慮事項など、培養肉足場開発における使用のために探索される可能性が最も高い技術については、次のセクションで議論されるであろう。

Cultivated Meat Science Discussion Series III: Bioengineering, part B

序章

市場に出回っている食肉製品は、構造的に洗練されたものが多い。その一端には、すり身やホットドッグのような高度な加工品、中間にはハンバーガーやソーセージのようなひき肉、そしてもう一端にはヒレやステーキがあります。より洗練された製品を再現するためには、肉の複雑な多細胞構造を再現するために、組織工学、再生医療、生体材料科学の技術を借りて改良する必要があります。以前に議論したバイオエンジニアリングとバイオマテリアルの知識を基に、複雑な多細胞食肉製品を作成するために考慮すべき主要な方法のレビューを以下に示す。

3Dバイオプリント

3Dバイオプリンティングは、コンピュータ支援設計（CAD）プロセスの指導の下で、細胞を含むプレポリマー溶液またはプレポリマー溶液（バイオインク）を基板上に層ごとに堆積させる添加剤製造技術です。ＣＡＤファイルは、通常、組織の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）やコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンなどの実際のバイオイメージングデータに基づいていますが、ユーザーが作成して無限のジオメトリタイプを形成することもできます。同様のイメージング戦略は、肉の特定のカットを複製するために実行することができる(Ebrahimnejad et al. 2018)。バイオプリンティングにはいくつかのタイプがあり、表１(Bajaj et al. 2014; Derakhshanfar et al. 2018)に要約され、以下に詳細に記載されている（図１）。

表1. バイオプリンティング技術の概要 From Derakhshanfar et al., 2018.

図1. 以下に説明する一般的なバイオプリンティング技術の視覚的な概要。培養肉の研究開発では、押出法や立体造形法が最も使用例があると考えられている。 From Jiang et al., 2019.

バイオインク

バイオインクとは、3Dバイオプリントの原料であり、細胞と他の何らかの生物学的材料との組み合わせで構成されている。バイオインク材料には大きく分けて2つのタイプがあります：スキャフォールドベースとスキャフォールドフリーです。スキャフォールドベースのバイオインクは、本質的には、細胞と一緒に印刷されるヒドロゲルであるのに対し、スキャフォールドフリーのバイオインクは、組織ストランドやスフェロイドなどの大きな細胞成分のみを含んでいる(Hospodiuk et al. 2017)。 バイオインク内の細胞は、通常、バイオインクの体積の5％以下を構成する、1ml当たり～1000万個の細胞濃度で存在する(Moroni et al. 2018)が、これは、特定の組織を複製するのに十分な印刷細胞を可能にするために、ケースバイケースで最適化することができる。しかし、重要なことは、これまでに議論したすべての生体材料がバイオインクで使用するためのパラメータに適合するわけではないということである。バイオインクのために考慮すべき主なパラメータには、「バイオプリンティング性」またはレオロジー特性（粘度、チキソトロピーなど）、機械的特性、細胞培養液への不溶性、コスト、および製造能力が含まれます。天然の生体材料は一般的に機械的特性が弱いため、バイオインクに含める際には特別な配慮が必要です。さらに、各バイオプリンティング方法は、これらのパラメータに異なる影響を与えるため、用途に応じて選択される方法を決定する傾向があります。培養肉の場合は、食品グレード（シリーズ IV のパート C で説明）のバイオインクが必要となる。

押出バイオプリンティング

押出ベースのバイオプリンティングでは、ステージまたは押出機自体が移動している間、押出機が連続的にバイオインクを堆積させます。バイオインクの堆積は、空気圧または機械的なシステムを介して行うことができ、2Dインクは、新しい層を追加する前に、拡散せずに形状を維持するために、化学的（光など）または物理的（温度など）に急速に固化されなければなりません。一般的に、押出しベースのシステムは、印刷可能なインク粘度の範囲（３０ｍＰａ・ｓ〜６０×１０⁶ｍＰａ・ｓ；参考までに、ケチャップは５０，００００ｍＰａ・ｓの粘度を有する）のために、多種多様な天然および合成生体材料の使用を可能にする、方法の中で最も使用され、汎用性の高いものである。押出ベースの方法は、基本的には液滴ではなく、より大きなフィラメント（直径150～300μm）を吐出することによって動作します。これは、足場ベースまたは足場なしの印刷の両方を可能にし、高細胞密度バイオインク、印刷されたスフェロイド、または細胞を含むマイクロキャリアを組み込むことができる(Hölzl et al. 2016)。しかし、これはまた、他の方法と比較して印刷解像度が低く（100μmと低い）、複雑な組織の複雑な複製を困難にする結果となる。剪断力は、押出しのためにヒドロゲルポリマーを自然に整列させるので、剪断薄化特性を有するバイオインクが好ましいが、押出し中の細胞生存性に対する剪断力の影響を慎重に考慮しなければならない(Hospodiuk et al. 2017)。さらに、ノズルの目詰まりを防止するためには、低い接着力と表面張力を有するバイオインクが必要である。押出ベースのバイオプリンティング方法を使用する3Dフードプリンタ、および食品を分析するために使用される技術（例えば、テクスチャーアナライザー）は、培養肉にも適応可能であるかもしれない。最後に、植物ベースのタンパク質のバイオプリンティングは、培養肉の足場の作成または肉の他の機械的、テクスチャー的、または有機物の特性の複製のために有益であり得る。これらの植物ベースのタンパク質の足場は、その後、培養された動物の脂肪とシードすることができ、結果としてハイブリッド製品を得ることができます（シリーズVで議論されています）。市販の3Dバイオプリントされた足場製品は、培養肉の研究開発にも使用することができます。

動画1. カーネギーメロン大学のエンジニアによって開発され、Hintonら、2015年に記載された「FRESH」と呼ばれる押し出しバイオプリンティング技術。その後、臓器サイズの足場を印刷できるFRESHの新バージョンが開発されました。 (Lee at al., 2019).

最近のいくつかの進歩は、培養肉生産に適用可能な厚い足場または組織の作成に向けて押出ベースの方法を適用する可能性を示している。例えば、研究者は、衝突を避けるためにスマートセンサーを備えた独立した印刷アームの制御下で、血管ネットワークと細胞の両方を同時に印刷するハイブリッドバイオプリンティング装置を開発した(Yu et al. 2014)。 この戦略は、追加の組織が印刷されている間、印刷された血管ネットワークを介した連続的な培地灌流を可能にする。また、複数のバイオインクを、多様なバイオインク間の高速かつ動的な切り替えで連続的に押し出すことができ、複数の細胞とヒドロゲル材料で構成された複雑な組織の印刷を可能にするシステムも開発されている(Liu et al. 2016)。 厚い足場をバイオプリントする際のもう一つの課題は、天然ポリマーの弱い機械的特性であり、その結果、自重で変形してしまうことである。この目的のために、ハイドロゲルは、構造的支持を提供する第二のハイドロゲル内に印刷することができる（ビデオ1）。犠牲的な」支持ヒドロゲルは、ビンガムプラスチックとして機能し、ここで、それは、押出ノズルとの接触点まで固体であり、印刷されたヒドロゲルが支持ヒドロゲルを変位させることを可能にする(Hinton et al. 2015)。支持ヒドロゲルは、その後、温度を上昇させること（例えば、ゼラチンを使用する場合）、またはカルシウムキレート剤（例えば、アルギン酸塩を使用する場合にはＥＤＴＡ）または酵素を適用することによって除去（すなわち、溶解）することができ、その結果、独立した足場または細胞を含む組織を得ることができる。犠牲ゲルもまた、人工血管の作成のために採用されている(Ji et al. 2019)。さらに、これらの前述の方法の利点を組み合わせることができ、制限の少ないヒトスケールの組織のバイオプリンティングを可能にする(Kang et al. 2016)。最後に、前述したように、足場内の生体分子の時空間的放出は、ECMのバイオミミクリを支援することができる。この目的のために、成長因子を含む３Ｄプリントされた光感受性ナノカプセルは、印刷中に足場内に分散させることができ、光を介して時空間的に制御された方法での細胞の誘導された移動を可能にする(Gupta et al. 2015; Meng et al. 2019)。押出バイオプリンティングにおけるこれらおよび他の進歩は、培養肉産業への応用に大きな可能性を秘めている。いくつかの企業が、培養肉生産パイプラインで押出ベースのバイオプリンティングを利用する計画を立てている。

ステレオリソグラフィー

ステレオリソグラフィーでは、単光子または多光子光源を使用して、感光性プレポリマーの浴中で迅速に重合させます。CADモデルから得られた構造は、マイクロミラーガルバノメーターで反射した光を介して再現され、印刷装置にフィードバックされ、重合の正確な空間的および時間的制御を可能にします。重合は、直接レーザー光を照射するか、連続した２次元層のボトムアッププロセスでマスクを介して露光するかのいずれかで行われる(Raman and Bashir 2015)。以前に記載された光架橋可能な生体材料の包含は、今、この技術を、細胞を含むプレポリマー浴からの構造物の足場生成または印刷のために使用することを可能にする。ステレオリソグラフィの利点は、以前に説明した考慮事項（例えば、ノズルを介して粘度、表面張力、およびせん断応力）の回避、自動制御（マスクレス法で）、高解像度（<100μm）、および高速印刷速度を含む。欠点としては、光曝露による潜在的な細胞毒性や、使用するのに適した生体材料のレパートリーが限られているが増えていることが挙げられる。また、より複雑な3D構築物へのさらなるスケーリングを可能にするためには、さらなる開発が必要であり、重合中の架橋反応を補助する食品安全で非細胞毒性の光重合開始剤の導出も必要である(Raman and Bashir 2015)。

最近の進歩は、培養肉の足場製造におけるステレオリソグラフィの使用の可能性を実証している。例えば、ステレオリソグラフィと誘電泳動を組み合わせることにより、細胞の精密な空間制御が可能になり(Bajaj et al. 2013) 、マイクロスケール連続投影印刷の進歩により、サブ10μm解像度のオブジェクトを数秒のオーダーで印刷することが可能になっている(Soman et al. 2013)。計算軸方向リソグラフィは、角度のついた画像投影を使用して、高速で構造体全体の同時3D印刷を実現します(Kelly et al. 2019)。非層状アプローチとして、それは、機械的に弱い生体材料のための支持性ヒドロゲル（前に議論された）の使用を必要とせず、容易にスケーリング可能であるはずである。ステレオリソグラフィ技術はまた、タートラジンおよびアントロシアニンのような一般的な光吸収性の食物色素を使用して複雑な血管系の構築を最近実証した(Grigoryan et al. 2019)。したがって、ステレオリソグラフィ技術のさらなる発展は、培養肉産業におけるそれらの使用を可能にする可能性がある。

液滴ベースのバイオプリンティング

液滴ベースのバイオプリンティングでは、ノズルと基板を直接接触させることなく、ピコリットルの液滴（直径10～50μm）を基板の上に堆積させる。液滴ベースのバイオプリンティングの最も一般的な形態はインクジェット印刷であり、液滴を電気源、音響源、熱源のいずれを介して作成するかにさらに分けることができる(Hospodiuk et al. 2017)。 これらのうち、電荷または熱の急激な増加によりノズルで圧力上昇を生じさせ、液滴を形成する圧電法および熱法が頻繁に使用されている。液滴ベースの方法は、各液滴に分布するセル数を正確に制御し、高解像度印刷(10〜50μm)が可能という利点があるが、バイオインク粘度の低い範囲(3.5〜12mPa・s)や、低い表面張力やまれなレオペクティック特性が要求されるため、複雑な構造体の液滴ベース印刷への応用は薄れている(Hospodiuk et al. 2017)。これらの理由から、液滴ベースのバイオプリンティングが培養肉に利用される可能性は低い。

レーザー支援バイオプリンティング

レーザー支援バイオプリンティングは、一般的にレーザー誘起前方移動（LIFT）とも呼ばれ、バイオインクの堆積を制御するためにレーザー誘起エネルギー移動を使用している。LIFTシステムは、金またはチタンからなる吸収性ドナー層と、ドナー層の下にバイオインク層があることを特徴としている。焦点を合わせたレーザービームはドナー層を気化させ、高圧の気泡を発生させてバイオインクを下の基板に堆積させ、そこでバイオインクはその後架橋される(Mandrycky et al. 2016; Moroni et al. 2018)。レーザーアシスト法は、機械的応力の問題を回避することができ、高い細胞生存率と高い解像度（10〜100μm、Hölzl et al. 2016）を有する粘性バイオインク（1〜300mPa・s）をバイオプリントすることが可能である。しかし、装置コストが高く、スケーラビリティが課題となっている。これらの理由から、レーザーアシスト法は、培養肉産業に翻訳される可能性は低い。

電解紡糸等の紡績繊維の製造方法

エレクトロスピニングは、高電界を印加している間にポリマーの溶液をスピナレット針に通し、多用途で低コストの技術です。電界により、臨界点（テーラーコーンなど）に達するまで、静電力を介してポリマーが引き伸ばされ（ビデオ2）、ファイバージェットが形成されます。繊維ジェットが形成されると、溶媒が蒸発し、繊維が硬化しながら、静電的に接地された収集装置上で収穫される（ビデオ3、Wang et al. 2013)。繊維自体は、様々な合成ポリマーや天然ポリマーから作ることができ、その結果、調整可能な直径と高い表面積を持つ多孔質繊維ネットワークが得られます。エレクトロスピニングは、ECM（直径50〜500 nmの繊維）のナノスケールのバイオミミクリを達成する唯一の方法を提供するという点でユニークです。注目すべきことに、細胞を含む生体材料は、繊維の堆積ではなく液滴の堆積をもたらす同様のプロセスを介してエレクトロスプレーすることもできる(Weidenbacher et al. 2017)が、これは足場の作成に向けての適用性は低いが。最後に、同様の繊維製造方法は、湿式紡糸、乾式紡糸、または溶融紡糸、および溶液ブロー紡糸(Daristotle et al. 2016) のような、足場(Farrugia et al. 2013) およびバイオリアクター（シリーズIIで議論される）で使用される中空繊維膜(Li et al. 1994) のような材料を製造するために使用することが可能である。

ビデオ2. エレクトロスピニング中のテイラーコーンの形成。

湿式紡糸の１つの形態は、液体沈殿浴にポリマーを押し出すために遠心力を使用する浸漬ロータリージェット紡糸(Gonzalez et al. 2016) である。この技術は、同等のエレクトロスピニングシステムと比較して、2～4桁の高い速度で様々な直径の繊維を製造することができ、より広範囲のポリマー材料で使用することができます（図2）。浸漬型ロータリージェット紡糸は、細胞を播種することができる食用ゼラチン繊維シートを作成するために使用されており、従来の食肉のいくつかの食感面がこの技術を使用して複製することができることを実証している(MacQueen et al. 2019)。しかしながら、使用された細胞入りゼラチンシートは薄く（厚さ1.5mm）、分化した骨格筋細胞または脂肪細胞を含んでいなかった。したがって、これらの変数がどのようにテクスチャー特性に影響を与えるかを調査するためにさらなる研究を行う必要があります（シリーズVで議論されています）。

図2 浸漬型ロータリージェット紡糸（iRJS）は、繊維径が変化する繊維を大量に作り出すことができ、培養肉の足場づくりの有力な候補になると考えられている。浸漬型ロータリージェット紡糸（iRJS）は、直径の異なる繊維を大量に紡糸することができ、培養肉の足場づくりの有望な候補となる。 (MacQueen et al. 2019)

ハイドロゲル形成、バイオインク、およびバイオプリンティングにおける生体材料について以前に議論したのと同じ考慮事項および原則の多くは、エレクトロスピン足場の作成にも適用されます。例えば、機械的には弱いが生体適合性のある天然ポリマーを合成ポリマーと組み合わせることが多い。しかし、複合材料に適した迅速に蒸発する溶媒を特定することは困難であり、溶媒自体が細胞毒性(Cheng et al. 2017) またはポリマーのネイティブ構造を損傷する可能性がある(Bürck et al. 2013)。バイオインクと同様に、粘度、溶媒表面張力、および流速の変化は、繊維の特性に影響を与え、印加電圧および回転速度、収集装置からの距離、または構造の変化は、結果として得られる足場の形状に影響を与え得る(Cheng et al. 2017; Khorshidi et al. 2016)。別段の意図がない限り、電気紡糸足場は、パックされた繊維のランダムな配列をもたらすことになり、これは、細胞の浸潤、移動、または均一な播種を制限し得る(Khorshidi et al. 2016)。プロテアーゼ分解性ポリマーの封入など、ヒドロゲルに使用される同様の方法は、細胞浸潤および遊走のためのネイティブECMをよりよく模倣することを支援し得る(Wade et al. 2015).。さらに、後述する混合紡糸、多層紡糸、同軸紡糸、エマルジョン紡糸、およびマイクロ流体紡糸を含む、定義された構造および目的を有するエレクトロスピン足場を製造するために、様々な方法が開発されてきた。

ビデオ3。エレクトロスピニングのセットアップ。

ECMの真のバイオミミクリはナノスケールの繊維を必要としますが、細胞の浸潤と灌流を可能にするためには、足場自体の空隙率がマイクロスケール上にある必要があります。ナノスケールとミクロスケールの両方の繊維ネットワークは、多層エレクトロスピニング（図3）を介して作成することができ、異なるナノファイバーとマイクロファイバーポリマーが層で順次電気紡糸されます。あるいは、混合エレクトロスピニングは、ナノファイバーおよびマイクロファイバーポリマータイプを同時に、コレクターの横方向の動きを介してオーバーラップ収集を可能にするコレクター上でエレクトロスピニングを実行することができます(Kidoaki et al. 2005)。 これらの技術は、細孔サイズに基づいて足場への浸潤から特定の細胞の浸潤を許可または制限することができ(Ju et al. 2010)、培養肉のための細胞播種の空間的分布に活用することができる。ゼラチンのような犠牲的な生体材料もまた、溶融時に追加の細孔を作成するためのポリマーとして使用することができる。

図3. 多層・混合エレクトロスピニング技術の視覚的描写。 From Kidoaki et al., 2005.

同軸エレクトロスピニングでは、内側と外側の溶液は、独立した供給キャピラリーを介して共エレクトロスピニングされ、複合テイラーコーンを形成する。一方の溶液は、典型的には疎水性ポリマーを含み、他方の溶液は、親水性ポリマー（例えば、デキストラン）で可溶化された関心のある生物学的カーゴを含み、それらの不混和性または混合不可能性のためにコア-シェル構造を生じる(Rim et al. 2013)。 同軸電気紡糸繊維は、タンパク質、細胞（後述）、またはそれらの放出速度を外殻ポリマーの空隙率または生分解性に基づいて変化させることができるような他の生体分子の捕捉を可能にする(Ji et al. 2010)、培養肉のアプリケーションのための成長因子の埋め込みによく役立つかもしれません。溶液の粘度、流動速度、および適用される電界強度はすべて、結果として得られるコア-シェル繊維の形状および特性に影響を与えることができます。さらに、2つ以上の溶液を共エレクトロスピニングすることにより、多層繊維を作製することができる(Labbaf et al. 2014)。同様のコア-シェル繊維は、油、水、界面活性剤、および生体材料のエマルジョンが共エレクトロスピニングされるエマルジョンエレクトロスピニングによって作製することができる。エレクトロスピニング中に、蒸発する油の粘度の上昇と印加された電場により、エマルジョン中の液滴が合体する。このプロセスは、成長因子または薬剤を埋め込むことができるコアシェル繊維を生成することができ、これは培養肉の足場に活用される可能性があります(Nikmaram et al. 2017)。

マイクロ流体紡糸（図4）は、流体の表面張力、エネルギー散逸、流体抵抗の違いに依存して、独立したサンプルとシースの流れの間に3D同軸の流れを生成します(Cheng et al. 2017)。同軸エレクトロスピニングに原理的に類似しているが、流体チャネル幅が繊維径を制御するため、電圧の適用は不要である。このように、マイクロ流体紡糸は、過酷な溶媒の回避のために、天然の生体材料のためのより好ましい環境を可能にする。電解紡糸とは対照的に、マイクロ流体紡糸は、繊維の形状、気孔率、繊維径をより厳密に制御することができるだけでなく、繊維径の均一性をより容易に達成することができます。これにより、簡単な細胞カプセル化が可能となり、細胞の整列、増殖、および３次元環境での成長を助けることができ、これらはすべて培養肉生産に有利である（後述）。結果として得られる繊維は、光重合、架橋、または溶媒交換を介して固化されなければならず、これはポリマーの選択をやや制限する。それにもかかわらず、アルギン酸塩のような容易に架橋された材料は、このようなシステムで容易に使用することができます。

図4. マイクロ流体紡糸の視覚的描写。 From Cheng et al., 2017.

脱細胞化

脱細胞化は、ネイティブECMを保存しながら組織から細胞と核酸を除去することを目的とした技術である。このようにして、脱細胞化された組織は、元の組織と同様の生物物理学的および生化学的特性を保持した足場として機能し、潜在的にボトムアップアプローチに関連する以前に議論された問題（例えば、気孔率、材料組成、剛性など）を回避することができます。脱細胞化は、臓器再生を目的とした動物組織を用いて主に先駆的に行われてきました（図5）が、この技術は植物や真菌の組織にも適用できます。このように、動物組織由来の技術の知見や応用は、培養肉の研究開発に役立つ可能性があり、実際には植物組織や真菌組織を利用する可能性が高いと考えられる。

図5. 脱細胞化は、臓器再生の目的で先駆的に行われてきた。このプロセスは、培養肉生産に使用される複雑な組織の再構築に貴重な洞察を提供することができます。 Image from Scientific American.

脱細胞化は、化学的、物理的、または酵素的方法を展開することによって行われる。イオン性（例えばSDS）、非イオン性（例えばTriton X-100）、または双性イオン性（例えばCHAPS）洗浄剤のような化学物質は、それぞれ、膜の可溶化、DNA-タンパク質および脂質-タンパク質相互作用の破壊、またはタンパク質の本来の状態の保護を助けるので、使用することができる(White et al. 2017)。しかしながら、これらの化学物質の過酷な性質は、これらの化学物質は本質的にECMタンパク質にも損傷を与えるので、低量で使用するか、または可能であれば全く使用しないことを導く(Badylak et al. 2011)。いくつかのケースでは、高分子の加水分解を触媒するための酸の使用、または細胞溶解を引き起こすための有機溶媒および低張性溶液の使用は、脱細胞化プロセスを支援することができる。また、凍結融解、エレクトロポレーション、撹拌、超音波化などの物理的な方法も、細胞溶解を補助するために適用することができる。最後に、トリプシン、ディパーゼ、ホスホリパーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、および他のプロテアーゼを含む様々な酵素は、脱細胞化プロセスを支援することができるが、ECMタンパク質に与えられる損傷のバランスを考慮する必要がある(Gupta et al. 2018)。異なる組織が異なる細胞組成、サイズ、および密度で構成されるように、各脱細胞化プロトコルは、ケースバイケースで最適化される必要があり、上述の方法の１つまたは組み合わせを含むことができる。

一般に、脱細胞化プロセスは、細胞および核酸を除去することと、ネイティブECMの完全性を維持することとの間のバランスである。臓器移植の文脈において宿主からの免疫応答を回避するためには、これらの成分のほぼ完全な除去が重要である。しかし、組織は宿主の中で生き残ることを目的としたものではなく、死んだ状態で摂取されるので、これは培養肉の場合はあまり気になりません。興味深いことに、いくつかの証拠は、残留抗菌ペプチドがキトサンと同様に一部の動物ECM足場に残留しており(Kong et al. 2010)、その代わりにインビトロや製品包装後の汚染を防ぐために活用できるかもしれないことを示唆している(Brennan et al. 2006)。

まとめると、培養肉分野は、以下に述べる脱細胞化および再細胞化プロセスから得られた知識から学び、応用することができる。

養殖肉に最も適用可能な脱細胞化技術は、灌流および撹拌浸漬である。灌流は、典型的には全臓器の脱細胞化に使用され、ここでは、ネイティブの血管系（典型的には主臓器の動脈）が共同利用され、生理的な圧力での脱細胞化試薬の灌流のための配管として使用されている。これは、多くの場合、生理的圧力が組織が損傷していないことを保証し、脱細胞化試薬が効果的に毛細血管を含む保存された血管系のすべてを浸透させることができる灌流バイオリアクター（シリーズIIで議論されている）で実行されます。アクセス可能なまたは大きな血管系ルートのない組織（例えば、骨格筋、皮膚）の場合、組織を脱細胞化試薬中に浸漬して撹拌し、拡散を介した組織の浸透を補助することができる(Garreta et al. 2017)。浸漬方法は、専用のバイオリアクターの必要性を必要としないが、それらはしばしば、脱細胞化試薬への長時間の暴露およびECM足場を損傷し得るネイティブプロテアーゼの細胞内放出をもたらすことがある(Gupta et al. 2018)。

脱細胞化は、2008年に脱細胞化されたラット心臓の最初のデモンストレーション(Ott et al. 2008)。 それ以来、ヒトの心臓 (Guyette et al. 2016) および四肢(Gerli et al. 2018) のような大規模で複雑な組織の脱細胞化、ならびに全筋肉(Zhang et al. 2016) のような培養された肉関連組織タイプの脱細胞化が達成されている。脱細胞化された足場に関する情報は、microCT、走査型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡、および免疫組織化学から得ることができ、それぞれ3Dアーキテクチャ、生体力学的特性、およびECMの組成に関する情報が得られます(Garreta et al. 2017)。この情報は、特に脱細胞化した骨格筋(Wolf et al. 2012) と特定の肉のカットの特性評価を介して、培養肉の足場の再現のために活用することができます。さらに、この情報は、3DバイオプリンティングのためのCADモデルの作成や、バイオインク(Pati et al. 2014) やエレクトロスピニング(Young et al. 2017) で使用するためのネイティブ脱細胞化ECM自体の可溶化のようなボトムアップの足場アプローチで使用される可能性があります。

脱細胞化は比較的容易になったが、再細胞化プロセスは、細胞送達およびバイオリアクター工学においてさらなる最適化を必要とするかもしれない。再細胞化のために、細胞は、典型的には、複数の注入にわたって、生理学的な流量またはそれ以下の流量で、血管灌流ラインを介して送達される。生理的流量は、ECMへの構造的損傷を防止し、せん断応力から細胞を保護するのに役立ち、これらの技術は、90％を超える臓器実質の播種効率をもたらした(Bijonowski et al. 2013)。キトサン、コラーゲン、ゼラチン、またはＲＧＤペプチドなどの生体材料で足場をプレコートすることは、再播種効率の向上をさらに支援することができる(Gupta et al. 2018)。組織が再細胞化されると、（細胞の付着に起因する）空隙率が制限されるようになると、流圧を動的に調整する必要があるかもしれず、この目的のためにモニタリングシステムを開発する必要があるかもしれない(Lawrence et al. 2009)。さらに、内皮細胞および血管系の確立は、これらの細胞タイプの経験された生理学的環境をより正確に模倣するために、脈動性の流れを必要とするかもしれない。しかしながら、足場内皮化が培養肉生産に必要かどうかは不明である(Badylak et al. 2011)。当該分野の少なくとも１社は、自社製品のための血管系の作成を挙げており、ウシ内皮細胞および平滑筋細胞は、テクスチャード大豆タンパク質足場上で成長させたときに、ウシ筋芽細胞の筋形成およびＥＣＭ沈着を増強した(Ben-Arye et al. 2020)。

脱細胞化された動物組織を足場として使用することの利点の１つは、それが、以前に議論された残留埋め込み成長因子、機械的特性、および他のＥＣＭ特性を介してコード化されたネイティブのサイトアーキテクチャーの「郵便番号」の位置を保持することである。したがって、再細胞化のプロセスは、高度に自己組織化されているが、再細胞化の前に細胞集団の分化状態を考慮するように命令する。培養肉生産に望ましい出発細胞型（シリーズＩで議論されている）のすべてが、筋芽細胞(Jank et al. 2015)、間葉系幹細胞(K et al. 2019)、胚性幹細胞(Nakayama et al. 2013)、および誘導多能性幹細胞(Jaramillo et al. 2018) を含む、再細胞化のために利用されてきた。実際、ハイドロゲル足場の実験と同様に、多能性幹細胞を用いた脱細胞化動物組織足場の再細胞化が、ネイティブ組織型への分化を指示するのに十分であることを示唆する証拠は、関連する細胞型マーカーの発現を増加させ、2Dプロトコル (Jaramillo et al. 2018) に対して機能性を増加させるだけでなく、局所的な微小環境に起因するネイティブ部分構造を組み立てることを示唆する(Nakayama et al. 2013)。同様に、間葉系幹細胞または誘導多能性幹細胞由来の前駆細胞などの多能性前駆細胞を用いた再細胞化は、分化した細胞型の多様性からなる機能的な組織に誘導することができる(Chandrika et al. 2019; Kitano et al. 2017)。成功した再細胞化（およびその後の機能的移植）は、体積が数十リットルまでの灌流バイオリアクター内の成豚肺と同じくらい大きな組織で行われており、プロセスがスケーラブルであることを示唆している(Nichols et al. 2018)。したがって、可溶化されたネイティブECMを用いた3Dプリンティング(Choi et al. 2016; Choi et al. 2019) のような方法を介した脱細胞化足場の再細胞化または再現から学んだ原理の採用は、培養肉の研究および開発への適用性が高いはずである。

図6. 原産の血管系は、植物組織でも動物組織でも同じようにパターニングの法則に従っている。From Gershlak et al., 2017.

動物からの脱細胞化足場の使用には、いくつかの制限がある。例えば、脱細胞化された足場の組成物は、個体間で変化し、年齢およびプロトコルの再生産性に影響され得る(Gershlak et al. 2017)。しかし、最も重要なことは、供給は限られており、したがって高価であり、数百までのタンパク質を含むECMを再構築することは実行可能ではないということである(Nakayama et al. 2013)。これらの理由から、植物は、その細胞壁がセルロース、ペクチン、ヘミセルロースなどの豊富な生体適合性多糖類で構成されていること、およびマレーの法則に従う動物に似た固有の血管系で構成されており、灌流を可能にすることから、脱細胞化戦略のための魅力的な代替手段となっている（図6）。実際、以前に議論された機能化方法と組み合わせて、脱細胞化された植物足場への哺乳類細胞の付着は、様々な植物の茎、葉、またはハイパータンチウム組織を用いて実証されている(Fontana et al. 2017; Modulevsky et al. 2014)。機能化された植物足場は、生来の剛性、親水性、地形、および細孔サイズの違いがそれらの成功に影響を与え得るが、長期的な生存性および細胞増殖を実証してきた(Fontana et al. 2017)。将来の遺伝子工学の取り組みは、シルクで行われているように、生体適合性タンパク質ドメイン（例えば、ＲＧＤ）を発現するように植物を改変し得る(Widhe et al. 2016) 。

植物の多様な在来組織構造は、異なる肉の切り口を再現するために活用することができる。例えば、脱細胞化セロリ(Campuzano, Mogilever, and Pelling. 2020) およびネギ(Cheng et al. 2020) は、整列した筋線維を作成することが実証されている。重要なことに、植物足場の構築は、より大きいまたはより豊富な植物組織を使用すること、または以前に議論された方法(Krona et al. 2017) を使用してテクスチャーのあるタンパク質またはセルロースベースの足場を作成するために原料植物材料を処理することによって、単純に容易にスケールアップすることができる。植物ベースの材料は、組織工学のためのセルロースまたは澱粉のような豊富な原料植物材料の加工および使用がよく特徴づけられており(Jovic et al. 2019) 、動物性タンパク質のための組換え技術は、生産のためのより多くの入力のために、より高価なままである可能性が高いため、動物性ECMの対応するものと比較して、スケールで有意にコスト効率が高いものとなるであろう。また、真菌菌糸体の使用は、脱細胞化の要件を必要とせず、スケーラブルで手頃な足場基質として機能する可能性がある（図7）。エクセルバイオという会社は、この可能性を探るために2019年に設立されたばかりである。温度、二酸化炭素、湿度、気流、または糖源と組み合わせて種菌株をヒトが制御することで、予測可能な構造体の成長を可能にすることができる。このように、人間の臓器生成のために開拓された技術を借りて、植物界と真菌界を実用性のために活用することで、自然界によるプレハブ足場の使用は、培養肉産業で最も定着する可能性が高いかもしれません。

図7. 真菌の菌糸体は、細胞の成長のための天然の足場構造を提供します。異なる糖源に反応したP. janczewskiiの菌糸体構造の走査型電子顕微鏡写真を示す。From Pessoni et al., 2015.

その他の考慮事項

一般的に、in vitroで幹細胞から細胞を誘導すると、サイズ、形状、遺伝子発現、機能などの様々な未熟な表現型が生じ、それらはまとめて胎児の状態と成体の状態を比較して、より類似したものとなる。この現象は、細胞が３次元空間に制限されている２次元培養条件下で最も明らかであり、その結果、ＥＣＭ媒介のメカノトランスダクション、細胞極性、および細胞間の相互作用に変化が生じる(Tibbitt and Anseth 2009)。さらに、動的な空間勾配とは対照的に、均一に分布した成長因子を含む細胞培養培地への曝露は、様々な細胞の行動に影響を与え得る(Ashe and Briscoe 2006)。これらの理由から、in vitroでの細胞のさらなる成熟は、幹細胞生物学者にとって重要な 研究分野であり、構造化された培養肉製品にも影響を与えている（シリーズVで詳述）。例えば、未成熟な筋管は、成体動物の筋肉と栄養や食感を一致させるために必要な成体の肉質タンパク質を含んでいない場合がある(Listrat et al. 2016)。これまでに議論した方法はすべて、主にECMのバイオミミクリーを介して、細胞が成長する3次元のin vivo環境を再現することを目的としている。実際、幹細胞由来の細胞を動物に移植することは、機能的成熟度を増加させるための最もよく特徴づけられた方法である(Incitti et al. 2019)。しかしながら、以下で議論される培養肉生産のための細胞の成熟のために、追加の方法を利用することができる。

図8。ナノトグラフは、厳密に平坦な表面上のランダムな配向（c）と比較して、筋管の整列と成熟を支援することができます（a）。 From Xu et al., 2018.

生体内では、骨格筋繊維およびそのコラーゲンに富んだECMは高度に整列しており、したがって異方性である。したがって、ECMの気孔率および他の特徴を模倣することに加えて、マイクロまたはナノパターン化されたトポグラフィー上または内での骨格筋の成長は、整列、分極、および筋管の成熟状態および機能的出力を増加させることができる（図8、Kim et al. 2012)。骨格筋チューブのような電気的に活性な細胞の場合、刺激は、繊維タイプの組成（シリーズVで議論されている）、成熟、および肥大（すなわち、成長、Gundersen 2011) に影響を与えることができるよく知られている下流の遺伝子転写変化を導くことができる。骨格筋の電気刺激（ビデオ４）は、生体内の神経筋接合部を介して媒介されるが、運動ニューロン入力がない場合には、電気パルス刺激を介して同様の効果を達成することができる(Ito et al. 2014)。さらに、ポリアニリン(Jun et al. 2009)、金またはチタン(Yang et al. 2016) のような導電性ポリマー上での筋管成長、または静磁場の存在下での筋管成長(Coletti et al. 2007)は、筋管の整列および導電性表面またはギャップジャンクションを介した細胞内カルシウムシグナルの伝播を介して、部分的に筋管成熟を補助し得る(Coletti et al. 2007)。同様に、筋チューブを含む3Dバイオプリントされた足場の中に運動ニューロンが存在すると、筋チューブの形成と成熟が改善され、おそらく機能的な神経筋接続が行われることになる(Kim et al. 2020)。最後に、多くの幹細胞由来の筋管の集団は、収縮性を媒介する肉膜構造の発達に伴って自然に収縮する。本質的には、インビトロで骨格筋を「運動させる」能力は、最初の細胞ベースのミートバーガーの生産に使用されたことで実証されたように、細胞の全体的なサイズおよび成熟状態において重要な決定因子である。

動画3.ヒト幹細胞由来の運動ニューロンと共培養すると、ヒト幹細胞由来の筋管が収縮する。同様の収縮は、外因性の刺激や導電性ポリマー基質上での成長から生じることがあります。 From Swartz et al. 2020.

しかしながら、インビトロでの筋収縮を調査している多くの研究は、初期のものであり、小規模であり（多くの場合、意図的にバイオロボティクス分野(Ricotti et al. 2017)、力の発生を補助するために腱のように作用するために構造化された柱を使用しており(Cvetkovic et al. 2014) 、構造化されたコラーゲンおよび疎な線維芽細胞は、生体内で見られるかもしれないか、または足場内で使用されるかもしれないようなものよりもむしろ使用されている。したがって、大規模なバイオリアクター内または足場内で培養肉を「運動させる」ための戦略の選択は、挑戦的であり、新たな技術革新を必要とするかもしれない。例えば、細胞培養培地への直接的な電流印加は、培地成分のイオン化を引き起こし得るので、刺激の強度、周波数、および周期性を最適化する必要があるだろう(Pascoal-Faria et al. 2019)。最後に、収縮時に発生する力に耐えるための足場の構造的完全性についていくつかの懸念がありますが、しかしながら、in vitroの筋肉構築物からこれまでに発生した力は、in vivoの骨格筋よりも桁違いに低く(Ricotti et al. 2017) 、培養肉でのアプリケーションのための重要な問題を提起することはほとんどありません。

図9 マイクロスケールチューブは、3Dマイクロ環境内で高密度に細胞を成長させるための多くの潜在的な利点を提供します。 From Li et al., 2018.

シリーズIIで議論されているように、バイオリアクター内の懸濁液成長におけるアノイキスを回避する一つの方法は、細胞を凝集体、スフェロイド、またはオルガノイドとして成長させることである。この方法の大きな利点は、２Ｄ成長との関連で高度な自己組織化および成熟を可能にする３Ｄ成長環境である(Hu et al. 2018)。しかしながら、比較的新しいオルガノイド分野における再現性は、課題であり、活発な研究の領域である(Huch et al. 2017)。さらに、オルガノイド成長から足場上に細胞を移行させることは、細胞がすでに事前にパターン化されており、自己組織化されているので、反直感的であろう。したがって、これらの方法論は、非構造化製品（シリーズVで議論されている）で直接使用するために細胞数をスケーリングするために十分に役立つかもしれないが、プレハブ足場を含む構造化製品に容易に組み込むことはできないだろう。

これを回避するための潜在的な回避策は、ハイドロゲルコアシェルチューブ構造にカプセル化された細胞を生成するために、マイクロ流体紡糸(Onoe et al. 2013) または同軸マイクロ押出し(Li et al. 2018) を使用することであるかもしれません。これらの技術は、カルシウムの存在下でのアルギン酸などの容易に架橋可能なヒドロゲル内に細胞を共押出しすることによって機能する。例えば、直径400μmの細胞充填チューブを作成することで、酸素、栄養素、および廃棄物が多孔質ヒドロゲルを通過するため、質量輸送の制限に悩まされることなく、3次元の微小環境内で細胞を容易に増殖させることができます。さらに、細胞は、バイオリアクター内のせん断力から遮蔽され、マイクロスペースの5x10⁸細胞/mLまでの驚くほど高い密度を達成することができ、そして分化は、培地の変化を介して達成することができる（シリーズIVで議論されている）（ビデオ4、図9、Lin et al. 2018)。成熟は、コア-シェルチューブ自体の内部で起こることができ(Hsiao et al. 2015)、増殖、分化、および成熟のプロセス全体が単一ユニット内で起こることを可能にする。これは、効果的にシードトレインのスケールアップやバイオプロセス中のバイオリアクターのフォーマットの切り替えを回避することができます。

コアシェルチューブの作成は、チューブの長さと押出機の並列化の両方でスケーラブルである。チューブは、柔軟性があり、構造的に健全であり、排出または吸引によるハンドリングを可能にし、高度に自動化された繊維産業に類似したツールおよび方法を用いて複雑な構造に織り込むことができる(Onoe et al. 2013)。さらに、アルギン酸塩は、カルシウムキレート剤または酵素の存在下で溶解することができ、その結果、取り扱い後に純粋な細胞構造になる。織物ベースのアプローチはまた、編み物、かぎ針編み、編み物、織布、および巻物にすることができる繊維芽細胞および細胞外マトリックスの収穫された混合物を使用して実証されている(Magnan et al. 2020)。したがって、これらの戦略は、スケールアップおよび構造化された製品の作成に関連する様々な課題に取り組むための非自明な解決策を提供する可能性がある。

ビデオ4. コアシェルヒドロゲルマイクロチューブ内で大量の細胞数を低容量で生産するための同軸マイクロエクストルージョン。 Yuguo Lei lab, University of Nebraska-Lincoln

バイオリアクターに埋め込まれた足場の灌流に関する考察

以前にシリーズIIで説明したように、撹拌タンクバイオリアクター内の乱流、気泡の破裂、またはスリップ速度の違いによるせん断応力は、細胞にかかる力は、遊走、分化、増殖、および生存率に影響を与える可能性があるため、重要な考慮事項です。同様に、酸素と栄養素を提供するための足場を介して灌流の流れはまた、細胞上のせん断力を生成することができます。多孔質構造体を通る灌流流は、一般に、流れの長さに関連する圧力損失と液体の速度との関係を記述する透水性のダーシーの法則に従うであろう(Li et al. 2019)。足場が大容量バイオリアクター内に埋め込まれるように設計されている場合、そのサイズは、せん断または栄養物質の質量移動に起因する細胞の生存性を維持するために、事実上制限されてもよい。

図10. 足場の形状、細孔サイズ、およびボイド充填を変えた場合の異なるせん断応力分布が記録されている。 From Guyot et al. 2015.

例えば、わずか数ミリの厚さの足場を通る流体の流れに起因するせん断応力は、細胞が2次元とは異なる3次元のせん断応力に反応する傾向があるため、足場内の細胞の増殖、分化、およびECMの沈着に影響を与える可能性があります(Zhao, Chella, and Teng. 2006)。これは、異なる種類の細胞が異なるせん断応力に応答するという事実のために複雑であり、不均一な多孔質性または機械的特性を持つ足場は、結果として、せん断、流体の流れ、およびしたがって、栄養物質の質量移動の局所的に変化する微小環境を持つことになります。さらに、細胞の増殖と成熟に起因する足場内の空隙の充填もまた、せん断、流体の流れ、および栄養素の質量移動に影響を与えるでしょう（図10;Guyot et al. 2015)。したがって、培養肉のための材料や構築方法の合理的な選択を情報提供し、足場の播種後の動的な細胞挙動の理解を深めるためには、異なる足場の設計や材料を通る流体の流れの計算モデル化が必要とされる(Maes et al. 2009; Raimondi et al. 2006)。流量の動的な調整を可能にするセンサーシステムの作成も必要とされるであろう。哺乳類細胞増殖のための既存のバイオリアクターは、代謝物またはタンパク質を生産するために使用される真菌または植物の毛根培養の生産に使用される固体発酵から学んだ原理と同様に、最良のアプローチへのいくつかの洞察を提供するかもしれない(Wang et al. 2019)。さらに、ガンマおよびＵＶ照射またはエチレンオキサイドなどの足場のための滅菌手順は、特定の生体材料を変性または損傷させる可能性があり、その結果、特定の原料の選択肢が制限される(Caliari and Burdick 2016)。これらの課題のすべてに対処するための先見の明のある戦略を追求すべきである。

培養肉の足場のまとめ

この情報をまとめると、培養肉用の足場構造は、最先端の組織工学の複数の側面を活用する必要があると思われる。足場は、細胞の移動（約１〜５００μｍ）、連続的な灌流、および細胞培養液のリサイクル（シリーズIV、パートCで説明）に適した高い生体適合性および気孔率を有する安価で食用または生分解性の生体材料で構成され、廃棄物を除去し、栄養の供給をリフレッシュする。これは、ネイティブ組織アーキテクチャ（例えば、脱細胞化）を利用してもよいし、設計によって構築されてもよい（例えば、３Ｄプリンティング、紡糸技術、コアシェルチューブ）。足場は、肉の細胞構造を再現するように予めパターン化された異なる複合生体材料で構成されていてもよいし、幹細胞の分化した細胞への付着、移動、および成熟を助けるために、異なる剛性および／または埋め込まれた成長因子で構成されていてもよい。培養肉には機能的な組織に必要とされるようなミクロスケールの精密さや組織化は必要ないため、これは当初の印象よりも難易度が低いかもしれない。あるいは、管状(Li et al. 2018) または薄板(Allen et al. 2017; Takahashi, Shimuzu, and Okano. 2018) 構造で成長した細胞は、添加物製造の原理を用いて食肉製品に構築されるかもしれない。

必要とされる細胞成熟のレベルは、おそらく最終製品の栄養学的および食感上の要件によって決定されるであろうし、実際にはオプションのスペクトルが考慮され得る。シリーズVで議論されるように、プロセスの困難な性質のために、ここで説明されているような非構造化製品と構造化製品のリリースには、何年もかかる可能性がある。現在の組織工学の実践は法外に高価で技術的に困難であるため、スケーリング、コスト、および再現性の懸念に対処するためには、新たな技術革新によって大きな課題に対応する必要があるだろう。このような状況にもかかわらず、現在の技術は、将来の構造化培養肉製品を成功させるための基礎的なロードマップを提供している。組織工学と培養肉の科学者は、知識を共有し、共有された問題について共同研究を行うことを奨励されるべきであり、その結果、それぞれの分野で相互にプラスの利益をもたらすことになる。

栽培肉学ディスカッションシリーズIV：細胞培養液、そのA

序章

細胞を生体外で増殖させるには、生体内で必要とされるのと同じ基本的な入力が必要である：炭素ベースのエネルギー源（グルコースなど）、アミノ酸、塩類、ビタミン、水、および細胞の生存力と活力をサポートするその他の成分の混合物。この混合物は、細胞培養培地として知られており、細胞培養技術において最も重要な要素である。細胞培養は学術研究室や産業用バイオプロセスで日常的に行われていますが、競争力のある価格で大量市場への普及を達成するために培養肉に必要なバイオマスを作り出すには、コストの大幅な削減、血清除去のためのイノベーション、多様な種や細胞タイプのセット全体での最適化が必要となります。細胞培養液の組成の概要と、従来の食肉との価格同等性を達成するための要因を以下に説明する。

細胞培養液の一般的な成分

体外で組織を培養した最初の例は、1882年にシドニー・リンガーによってもたらされました。リンガーは、動物の体内と同じようなpH、浸透圧、塩濃度のバランスのとれた塩水溶液を作ることで、様々な動物の組織を体外で数日間生きた状態に保つことができました。その後の数十年の研究では、血漿（血清）や胚抽出物の存在下で細胞を培養すると、細胞の増殖と生存率が向上し、組織をより長期間生存させることができることが最初に実証されました。時間の経過とともに、研究者たちは、使用される血清中のグルコース、アミノ酸、グルタチオン、インスリン、およびビタミンの重要性を特定した(Yao and Asayama 2017)。これが判明すると、科学者たちは、細胞の増殖と生存を可能にする血清や他の抽出物の追加の未知の必須成分を明らかにすることを目指しました。

1940年代および50年代には、L細胞(Earle et al. 1943) およびHeLa（シリーズIで議論されている）のような最初の不死化細胞株を用いて、科学者たちは、アミノ酸を含む血清の低分子量透析画分が細胞の生存に必要であることを発見するために、反復的なアプローチを用いた。1955年、ハリー・イーグルは、いくつかの異なる細胞株でアミノ酸の必要量を試験して、13種類のアミノ酸が必須であることを発見し、最小必須培地を開発しました（図1）。イーグルのミニマムエッセンシャル培地は、さらにグルコース、6つの無機塩、8つの水溶性ビタミン、および透析済み血清で構成されている。この培地のバリエーションは、血清を化学的に定義された成分で置き換えることを目的とした試行錯誤のアプローチと同様に、様々な異なる細胞株を使用して導き出されました。Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)、Iscove’s Modified DMEM、Ham’s F12、Medium 199、RPMI 1640、Leibovitz’s L-15、およびその他を含むこれらのバリエーションは、今日使用されている様々な細胞タイプを培養するために使用されている基底細胞培養培地と呼ばれるものの大部分をまだ構成しています(Yao and Asayama 2017; Arora 2019)。

何がこれらの製剤を不可欠なものにしているのでしょうか？製剤は時代とともに変化し、最適化されてきたが、基底細胞培地の主要成分はほとんど変化していない。重要なことに、これらの変動は、培養肉に使用される細胞タイプ（シリーズⅠに記載）を含めて、細胞タイプ特異的である可能性がある。したがって、特定の細胞株または種に対する最適な条件を議論するのではなく、グルコース、アミノ酸、無機塩、ビタミン、および緩衝剤を含む一般的な基底培地の各構成要素の一般的な役割のみを以下に簡単に議論する。

図1. グルコース、13種類のアミノ酸、8種類の水溶性ビタミン、および6種類の無機塩を含むイーグルスミニマムエッセンシャルメディウムの製剤。これらの成分の役割については後述する。フェノールレッドはpHインジケータである。 From ThermoFisher.

グルコース

グルコース（具体的には D-グルコース）は、細胞培養に使用される最も一般的なエネルギー入力ですが、一部の培地製剤ではガラクトース、またはグルコースとその代謝物であるピルビン酸の組み合わせを使用している。工業的には、トウモロコシ、ジャガイモ、小麦、および他の作物のでんぷんを、工業化された食品、発酵プロセス、またはこの場合は細胞の培養などの様々な下流製品で使用される構成糖に分解するために、アミラーゼ酵素を使用して酵素的に生産されます。グルコースは、その濃度勾配（より一般的な）またはATP依存性のアクティブな輸送を下に受動的な輸送のいずれかを使用して、細胞表面上のトランスポータータンパク質を介して細胞に入ります。細胞内に入ると、それはペントースリン酸経路を介してNADPH生成の形で酸化ストレスに対する還元剤としてだけでなく、解糖を介してATP生成の形でエネルギーの一次ソースとして機能します。

細胞培養では、グルコースは、5.5〜55mMの間の濃度で使用され、ここでは、下端がより一般的であり、ヒトの空腹時血中グルコースレベルに類似している。異なる細胞タイプでは、異なる量のグルコースを必要とします。一般的にバイオプロセシング中に維持されるような細胞の急速な増殖および成長の期間中は、グルコース代謝が高く、十分な酸素の存在下でも乳酸を産生し、ｐＨの変化をもたらすことがある(Zagari et al. 2013)。 したがって、グルコース利用および乳酸レベルは、一般的に測定され、バイオプロセス全体にわたって厳密に制御される（シリーズIIで議論される）。

アミノ酸

アミノ酸は、タンパク質をはじめ、ヌクレオチドや小ペプチドなどの低分子化合物を作るのに必要な物質です。アミノ酸は必須アミノ酸と非必須アミノ酸の2つのグループに分けることができます。非必須アミノ酸（NEAAs）は、必須アミノ酸（EAAs）は食事を介して取得する必要があるのに対し、動物によってde novo合成することができます。一般的に、脊椎動物の種では、NEAsのde novo合成のための経路は保存されている(Hou, Yin, and Wu 2015)。ヒトおよび他の多くの動物では、EAAsには、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、およびバリンが含まれる。NEAAには、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、タウリン、およびチロシンが含まれます。しかし、EAAの要件は、種によって異なる場合があります。例えば、犬、牛、豚は、猫と鶏はそれぞれ、前者に加えてタウリンとグリシン、と同じEAAを必要とするのに対し、人間プラスアルギニンと同じEAAの要件を持っている。

図2。必須アミノ酸と非必須アミノ酸は、in vitroでは不在である特定の細胞タイプで優勢に駆動されているいくつかの生合成経路のために異なります。したがって、追加のアミノ酸は、細胞培養で必須になります。

重要なのは、細胞培養で “必須 “であると考えられているものは、生体内で特定のアミノ酸を合成する可能性がある細胞型の多様性がin vitroでは存在しない（図2）として、生物全体に “必須 “と考えられているものとは異なります。例えば、イーグルの最小エッセンシャルメディウム製剤は、in vitroで複数の細胞株にわたって必須であるとして13（L-エナンチオマー）アミノ酸をリストアップしています：アルギニン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン。一例として、アルギニンは生体内での生合成が主に腸の上皮細胞と腎臓の近位尿細管細胞の間で行われるため、生体内では必須である。従って、アルギニンはこれらの細胞タイプの非存在下で供給されなければなりません。特に栄養豊富な培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２または培地１９９）は、すべてのアミノ酸を含むことができる。あるいは、ＮＥＡｓを独立して補充することができる。

図3. 炭素14トレーサーを使用して、Hosiosらは、複数の細胞株にわたる炭素バイオマスの大部分が、グルコースおよびグルタミンではなくアミノ酸に由来することを決定した。 From Hosios et al, 2016.

アミノ酸の工業化された生産は、タンパク質加水分解物からのバルク抽出（後述）、化学合成、または微生物発酵および精製によって得ることができ、後者が最も一般的である(D’Este, Alvarado-Morales, and Angelidaki 2018)。アミノ酸は、タンパク質の生産レベル、細胞周期の状態、および他のパラメータに起因する細胞の状態および消費率に影響される速度で、細胞表面上の様々なトランスポータータンパク質を介して細胞に入る。細胞内に入ると、アミノ酸は多くの生合成経路の基質として機能し、最適な濃度は代謝平衡を維持するために重要です。増殖細胞における炭素質量の大部分は、これらが最も急速に代謝されるにもかかわらず、グルコースまたはL-グルタミンよりもむしろバルクアミノ酸に由来する（図3、Hosios et al. 2016)。

最終的に、細胞培養に必要なアミノ酸のレベルは、成長中の細胞によるそれらの利用だけでなく、個々のアミノ酸の溶解度、安定性、および金属カチオンなどの他の培地成分との相互作用によっても決定され、これらはすべて、複雑な混合物中で一旦変化し得る(Salazar, Keusgen, and von Hagen 2016)。これらの変数のすべてを考慮することは非常に複雑であり、バイオプロセスにおけるアミノ酸の挙動、利用、および最適化の完全な理解はまだ達成されていない。アミノ酸が関与する生合成経路の多様性を考えると、アミノ酸の含有量、濃度、および灌流速度（該当する場合）は、最終製品中の成長速度またはタンパク質含有量などのパラメータのために、種および細胞タイプをまたいで特定のバイオプロセスに対して最適化する必要がある可能性が高い。アミノ酸および他の基底媒体成分の特定の利用率をモデル化するための計算上のアプローチは、活発な研究分野である（Quiroga-Campano、Panoskaltsis、およびMantalaris 2018）（後述）。

Ｌ-グルタミン

L-グルタミンは、細胞内に容易に輸送され、タンパク質バイオマスへの主要な貢献者となるため、細胞培養培地に含まれる最も重要なアミノ酸の一つとして特別な考慮に値する。それは、他のアミノ酸およびヌクレオチドの合成に使用される中間分子のような炭素および窒素含有生体分子の顕著な前駆体であり（DeBerardinis and Cheng 2010）、それは培地中の他のアミノ酸よりも3〜40倍高い濃度で添加することができる（Yao and Asayama 2017）。高い細胞増殖と増殖の際には、グルタミンの需要がその供給を上回るため、グルタミンは事実上の必須アミノ酸となっており、代替エネルギー源の補充として容易に代謝されることができます（すなわち、アナプレローゼ）。細胞培養液の生理学的pHでは、L-グルタミンは不安定であり、その結果、ピログルタミン酸とアンモニアに分解され、後者は細胞に有毒である。したがって、アンモニアは、急成長中の細胞を高密度に含む大規模なバイオプロセスでは、厳密に監視され、規制された代謝物である（シリーズIIで議論されている）。

L-グルタミンのこれらの欠点のいくつかを回避するために、溶液中でより安定であるグルタミン酸は、プロセスでアンモニアを消費しながら、グルタミン酸のグルタミンへの細胞内変換を可能にする酵素であるグルタミン合成酵素を高レベルで発現している細胞で作業するときに置換することができます。より一般的な練習は、細胞が内因的にジペプチド内のアミノ酸のより制御された使用のためにジペプチドを切断することを可能にするアラニル-グルタミン（すなわち、グルタマックス）またはグリシル-グルタミンの形で安定したジペプチドとしてL-グルタミンを補充することを含みます。細胞培養におけるアミノ酸代謝については、まだ多くのことが分かっていない。例えば、最近の発見は、L-グルタミンが多能性幹細胞の培養のために完全にディスペンサブルであることを示唆している(Vardhana et al. 2019)。

無機塩類

無機塩を含有することは、周囲の細胞培養液との細胞の浸透圧を確立し、維持する上で重要であり、また、酵素補因子や受容体および細胞外マトリックスタンパク質の重要な構成要素としても機能する。これらの無機塩は、溶液中で完全に解離する陽イオンと陰イオンからなる。元の最小必須培地溶液は、アールの塩溶液をベースにした６つの無機塩（塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、および炭酸水素ナトリウム）を含んでいる。他の配合物は、様々な細胞機能（後述）に特に重要な亜鉛、銅、および鉄を含む無機塩をさらに含む。

すべての細胞は安静時膜電位を維持しているが、ニューロンや骨格筋細胞のような興奮性細胞は、それらの機能や生存能力に容易に影響を与えることができるイオン濃度の変化に特に敏感である。したがって、これらの細胞タイプを取り囲む間質液をより正確に再現する、ニューロン (Bardy et al. 2015) および骨格筋細胞培養用の塩濃度に最適化されたいくつかの基底培地製剤が開発されてきた。培地内の浸透圧のオスモラリティまたは測定値は、典型的には２６０〜３２０ｍＯＳＭ／ｋｇ（溶質１ｋｇあたりのミリオスモール）であるが、これは、昆虫細胞のような変動する溶質濃度において特に頑健な細胞株によって変化し得る(Rubio et al. 2019)。培地の変化による急激な塩濃度の変化、または水の蒸発によるゆっくりとした塩濃度の変化は、浸透圧ショックを引き起こし得る。したがって、浸透圧の維持は、細胞培養の重要な要素である。

ビタミン

ビタミンは、細胞の維持と成長のための重要なコンポーネントとして機能する有機化合物のクラスです。ほとんどのビタミンは、食事や細胞培養液から直接摂取する必要がありますが、例外はほとんどありません（例えば、皮膚の線維芽細胞やケラチノサイトによって合成されるビタミンDや、腸内細菌叢によって低レベルで生産されるビタミンB群など）。ビタミンは脂溶性または水溶性のいずれかに分類され、大まかには酵素補因子、抗酸化物質、ホルモンとしての役割を果たすことができる。ビタミンは、摂取後、生体内で様々な方法で処理され、多くの場合、膜表面輸送体を介して腸管細胞への吸収で終わる複雑な配列で処理される。吸収に関与するこの複雑なシーケンスは、敵対的な環境（例えば、胃酸）または障壁（例えば、血液-脳-障壁）が存在しないため、in vitroではほとんど回避することができます(Said 2011)。したがって、ビタミンは、通常、in vitroで細胞によって直接処理され、吸収され得る単一の化学化合物として培地製剤に含まれている。

ビタミンはまた、各化合物が様々な特性を有するとはいえ、ビタミンの機能的役割を果たすことができる化合物群（すなわち、ビタマー）として効果的に機能することができる。微生物や植物におけるビタミンの自然生産は、微生物発酵を介してビタミンの工業生産を可能にしましたが、代謝工学戦略の改善は、産業における収量と持続可能性を高めるために必要とされている。これらの理由から、一部のビタミンは化学合成を介してより効率的に生産されている(Acevedo-Rocha et al. 2019)。

リボフラビン（ビタミンＢ２）、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）、パントテン酸（ビタミンＢ５）、ピロドキシンおよびピリドキサール（ビタミンＢ６）、ビオチン（ビタミンＢ７）、イイノシトール（ビタミンＢ８）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、およびコリンを含む水溶性ビタミンは、典型的には、安定性を提供するために、時には様々な改変形態で、細胞培養物に添加され、細胞培養物中で「必須」である。脂溶性ビタミンA、D、E、およびKは、基底培地の配合では除外されていますが、有機溶媒に溶解している場合には、必要に応じて添加することができます。アミノ酸のin vivoとin vitroでの要件が異なるのと同様に、脂溶性ビタミンは、特定の細胞タイプまたは身体機能に対して特定の役割を果たし、したがって、関連する細胞タイプを培養する場合にのみ「必須」となります。例えば、ビタミンAの代謝物であるレチノイン酸は、重要な発生形態素であり（詳細は後述）、多能性幹細胞から脊髄運動ニューロン細胞を導出するための培地に添加物として含まれることがある(Patani 2016)。安定化血清タンパク質の欠如は、光、熱、酸化、またはｐＨ変動を介して急速な分解をもたらす可能性があるので、無血清培地製剤を使用する場合（後述）、ビタミンの安定性について特別な考慮が必要である(Schnellbaecher et al. 2019)。これらの特性により、使用直前に粉末状のビタミンＢ群を再構成することが好ましい（後述）。

緩衝系

緩衝液は細胞培養液のpHを変化させる酸または塩基の組成の変化にもかかわらず、一定のレベル（哺乳類細胞の場合、一般的に7.4±0.4）でpHを維持するのに役立つので、細胞培養システムには不可欠です。バッファは、弱酸とその共役塩基、または弱塩基とその共役酸の混合物であり、各混合物は、溶液中の遊離プロトンまたは水酸化物イオンを吸収するためのスポンジの役割を果たし、全体のpHへの影響を最小限に抑える。細胞培養における緩衝系は、典型的には、ＣＯ２-炭酸水素系（図４）またはＨＥＰＥＳのような緩衝剤のいずれかで構成される。シリーズIIで議論されているように、CO2-炭酸水素系は、自然な緩衝系を形成し、重炭酸イオンと溶液中で平衡に達している5〜10％のガス状CO2の外因性添加によって達成することができます（多くの場合、バイオリアクターシステムでは、スパージングを介して供給される）。

図4. 重炭酸緩衝系とHenderson-Hasselbalch式に基づく培地のpH制御機構。炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）は水に溶解すると解離してナトリウムイオン（Na+）と重炭酸イオン（HCO3-）を形成し、後者は溶液中でH+と反応して炭酸（H2CO3-）を形成します。後者は溶液中でH+と反応して炭酸(H2CO3)を形成し、これが解離してCO2とH2Oになります。これらの2つの反応はそれぞれの平衡状態に達します。また、溶液中のCO2も気相中のCO2と平衡に達します。その結果、気相のCO2濃度を上げると、培地に溶解するCO2量が増え、H2CO3濃度が上昇してpHが低下します。一方、気相CO2の濃度を下げると、逆の反応でpHが上昇する。培地のpHとCO2やNaHCO3濃度との関係は、Henderson-Hasselbalchの式で表されます：pH=pKa+log[HCO3-]/[CO2]液相でのpH、ここでpKaは酸解離定数の負の対数です。From Yao and Asayama, 2017.

pHはゆっくりと細胞の呼吸とグルコースの代謝と乳酸の形成に加えて、溶液中の炭酸を形成する追加のCO2の放出のために時間をかけて変化します。結果として減少するpHの変化は、基底培地自体に炭酸水素ナトリウムを含有させることによって打ち消される。重要なことは、添加された重炭酸ナトリウムは、平衡を維持するために使用される大気中のCO2に比例することである。例えば、1.5〜2.2g/Lの重炭酸ナトリウムを含む培地では、5%のCO2が推奨され、3.7g/Lの重炭酸ナトリウムを含む培地では10%のCO2が推奨されます。

HEPESは、細胞培養系において、特にCO2曝露の非存在下で、補助的なバッファーとして使用することができる双性イオン性バッファーである。Good社の緩衝液の一つであるHEPESは、その高い溶解度、低毒性、膜不透過性により、細胞培養系での使用に魅力的なものとなっている。増殖力の高い幹細胞のスケールアップでは、高代謝による溶存CO2が細胞の増殖や栄養利用に悪影響を及ぼす可能性がある(Kimura and Miller 1996)。したがって、HEPESまたは他のGood’s buffersからの緩衝能力を追加した大気中のCO2レベルの存在下で細胞を培養することにより、溶存CO2を制限する試みがなされてきた(Brodsky et al. 2013).。 この戦略は、培養肉における将来のスケールアップの取り組みに有用であろう。緩衝液のコストも考慮に入れなければならない(Specht 2018)。

調製

便宜上、ほとんどの学術的・研究室規模の細胞培養は、市販の液体培地を使用して行われている。しかし、大量の場合は、再構成された粉末培地成分から液体細胞培養培地を現場で調製する必要がある。粉末培地の方が効率的に輸送・保存できるため、コスト削減と壊れやすい成分（ビタミンB群など）の劣化を抑えることができますが、最近発売されたGibco BenchStableなどの製品では、光への暴露を避ければ、DMEMなどの基底培地を最大12ヶ月間保存できるようになっている。理想的には、粉末状の培地は、利用するすべての成分を含み、溶解性と均質性を高めるために、混合物中の結晶化粒子の平均サイズを小さくするマイクロ化として知られているプロセスを経て作成されます。粉末は、使用する準備ができたら、通常、逆浸透、脱イオン、ろ過によって調製された高品質の水を使用して、専用のタンクで再構成されます。再構成された培地は、その後、濾過（例えば、0.22μmフィルターを通して）、照射、またはシリーズIIで説明されている他の方法（例えば、パルス電場）によってそれ自体が滅菌される。高熱を伴う滅菌の使用は、製剤の一部であるかもしれないいくつかの熱可溶性成分によって除外される。追加成分のための他の調製方法は、全体を通して論じられる。

血清

前述のように、基底培地製剤は、多くの場合、短時間の間細胞を生きたまま維持するのに十分であるが、それらが長時間にわたって効率的に増殖するためには、様々な動物血清（例えば、ウシ胎児血清、馬血清、および他のもの）および抽出物（例えば、ニワトリ胚抽出物）が歴史的に使用されてきました。注目すべきことに、体積ベースでは、ＦＢＳは、多くの学術的設定およびいくつかの工業的設定において、依然としてルーチンの細胞培養にしばしば含まれているが、血清を含まない製剤は、現在、それらの使用においてより支配的である。血清は、増殖性、胎児のような状態を模倣する成長と添付ファイル因子、ホルモン、抗酸化物質、脂質、および他のコンポーネント（すべて後述）が含まれている高タンパク質含有混合物です。実際、細胞培養に使用される血清の多くは、胎児動物由来のものであり、必要な成分が豊富に含まれている上に、発達的に未熟な免疫系のために免疫グロブリンや補体の含有量が低い。ウシ胎児血清（FBS）は、細胞培養に使用される最も一般的な血清であるため、このセクション全体で参照例として使用されます。

もともと1950年代後半(Puck, Cieciura, and Robinson 1958)に使用されていたFBSは、事実上すべての一般的なヒト、動物、さらには昆虫の細胞株の成長を補うことができるので、生物医学研究の主力となっている。多くの細胞培養用途では、培地の総量の5～20%の量で添加されていますが、FBSは細胞培養を行う際に最も高価な成分である。

FBSは、屠殺のために妊娠している牛の発見に続いて、妊娠の最後の3分の2の間に胎児の子牛からいつでも収穫されます。屠殺ラインの牛の最大8％が妊娠している可能性があると推定されており、FBSは食肉加工産業の副産物となっています(van der Valk et al. 2018)。胎児の血液を無菌的に採取し、低温で凝固させた後、遠心分離して凝固因子や血球を除去することで調製される。血清上清は、その後、ろ過され、残留微生物またはウイルス汚染、エンドトキシン、免疫グロブリン含有量、および総タンパク質を含む様々な品質管理のために評価され、瓶詰めされ、商業的に販売される前に、1リットル当たり1000ドルを超える価格で（執筆時、2019年7月）、品質管理パラメータに応じて（いくつかは後述）、業界やユースケースによって異なります。

図5. 血清の一般的な成分のばらつきは、異なる試験ロットからの範囲で示されているように、劇的なものです。From Baker 2016.

その長い使用の歴史にもかかわらず、FBSは、近年、その代替が優先されるようになったいくつかのよく知られた問題を有している。第一に、ＦＢＳは、数百または数千の異なる成分を含み、これらの成分の真の組成および量は不明であり、化学的に未定義の製品となっている。成分はまた、牛の飼料が異なる地域、同じ地域内のバッチ、採集の季節性、母牛が受けた抗生物質やホルモンの量と同一性、胎児の妊娠年齢によっても変化します。また、異なる性別の胎児から採取された単一のボトル入り製品に起因するばらつきもあります(Elhofy, n.d.)。このようなばらつきがあるため、世界中の研究室内で、また研究室間で、体外実験の再現性のなさに 血清が寄与していることへの懸念が高まっています(Baker 2016)。特定の性能の良い大規模バッチを購入する前に、複数の細胞株や実験にまたがる血清バッチの試験を含む厳格な品質管理は、産業界ではしばしば行われていますが、小規模な学術研究室にとっては、労働力と経済的な観点から負担が残る可能性があります。このように、FBSの使用の固有の変動性（図5）と不定性は、品質管理試験、実験的に再現性のないまたは相反する結果、および再現性のないシグナルを解剖するためのフォローアップ研究における複合的な外部コストにつながる。

第二に、ＦＢＳは、マイコプラズマ、ウイルス、および牛海綿状脳症を含む複数の生物からの汚染の可能性がある。マイコプラズマは、感染した細胞株の代謝および遺伝子発現の変異につながる寄生細菌の一群である。マイコプラズマは最も一般的な細胞株の汚染物質である可能性が高く、最近の推定では、細胞株の11％が感染しており、検査が日常的に行われていない地域では70％にも上るとされています(Olarerin-George and Hogenesch 2015)。現在、FBSは理論的にはマイコプラズマを捕らえることができるはずの0.1ミクロンのシステムを使って日常的にろ過されていますが、サプライヤーはこの保証をすることはできません。一般的な細胞株の汚染物質であるM. argininiとA. laidlawiiは、特に、その起源はFBSにリンクされており、細胞株の継続的な交差汚染は、FBSバッチがこれらの細菌に対して日常的に陽性であった1960年代と1970年代以降、研究室でこの汚染を伝播させてきた可能性が高い(Drexler and Uphoff 2002)。マイコプラズマから血清を除染するための追加の方法には、ガンマ線照射が含まれるが、これはまた、血清中の成長因子および他のタンパク質を損傷する可能性がある(Baker 2016)。このように、FBSの使用は、今日の細胞株における細菌汚染の非自明な量の原因となっており、いくつかの除染方法に由来する再現性と潜在的な未知の変動性に関する複合的な問題につながっている。

細菌汚染に加えて、FBSにおける悪意のあるウイルス剤の脅威も持続している。米国農務省とEUの規制では、原産地のすべての地理的地域からFBSに存在することが知られている8種類のウイルスの検査および／または処理（加熱または照射による）が義務付けられている(Hawkes 2015)。現代の製造方法では、検証済みのバッチでの汚染のリスクは低くなっていますが、製造者がスクリーニングで陰性であると主張しているバッチでも、ウイルス汚染が検出されることがよくあります(Gagnieur et al. 2014)。 同様に、牛海綿状脳症の原因となるプリオンタンパクを含むFBS（すなわち、狂牛病、ヒトでは変異型クロイツフェルト・ヤコブ病として発現する）の脅威は根強く、FBSの起源について文書化されたトレーサビリティに加えて、追加の検査を必要とします。例えば、米国、ニュージーランド、オーストラリアなどの国では、ウシ海綿状脳症の症例が文書化されていません。そのため、これらの国に由来するFBSは「より安全」であると考えられている可能性があり、しばしばかなり高い価格で取引されていることが多く、商業的な治療薬の血清供給量の最大90％を占めています(Schnitzler et al. 2015)。 この事実は、この分野での詐欺行為を助長しており、メーカーはより高い価格を要求するためにニュージーランドの偽ラベルを選ぶことがあります(van der Valk et al. 2018)。 業界団体はこれらの懸念を軽減するために結成された。それにもかかわらず、FBSからの汚染の固有のリスクは、実験やバイオプロセスの再現性を脅かし、価格変動を引き起こし、安全性よりも利益を重視する悪質な行為者を煽動する可能性さえある。汚染については、シリーズVで食品安全の観点からさらに議論する予定である。

第三に、FBS の世界的な供給量は限られており、収益性の高い成熟産業との競争が存在する。例えば、ワクチンや生物製剤産業は無血清製剤への移行を始めているが（後述）、細胞治療や幹細胞研究の台頭により、より一般的には現在の供給量を上回る需要が差し迫った状況になっている。FBSは、細胞治療のためのいくつかの上流工程の製造および拡張工程に今でも含まれている。FBSは、動物（すなわち、食肉や乳製品）当たりのより利益の高い製品の副産物であり、利益は農家ではなく食肉処理場によって保持されるため、農家は将来のFBSの需要を満たすために牛群を増加させるインセンティブがほとんどない(Brindley et al. 2012)。したがって、血清の利用可能性は比較的停滞しており、細胞療法が承認され始めると血清需要は劇的に増加するため、「血清のピーク」は満たされているという仮説が立てられています（図 6、Brindley et al. 2012). 実際、FBSの価格はすでに過去数年間で300％上昇し始めている。このように、血清の代替は、まず、全体的な入手可能性が限られてい ること、次に、製薬企業以外の企業が価格を下げられていることから、この分野での代替イノベーシ ョンに拍車をかけるであろうコストへの懸念によって推進される可能性がある。細胞ベースの食肉の場合、このコストの懸念はすでに法外なものであり、食肉製品は細胞ベースの治療法に匹敵する価格では正当化できないので、FBSは経済的にはノンスタートとなっています（現在、約50,000ドルの商品コストと数十万ドルの販売価格で販売されています）。

図6. 細胞治療産業の成長を外挿することで、「血清のピーク」に達した時期を予測することができるかもしれない。細胞治療製品が市場に出回り始めたばかりであることを考えると（赤いダイアモンド）、業界全体のイノベーションと無血清製剤の採用は、今後数年で標準になるかもしれません。細胞ベースの食肉産業の誕生は、このタイムラインをさらに加速させるかもしれません。 Adapted from Brindley et al. 2012.

最後に、FBSの使用は倫理的な問題を抱えており、その使用は養殖肉の基本的な利点の一つである動物福祉と本質的にずれている。1リットルの血清は1–3の胎児を必要とし、年間約200万頭の胎児の子牛が血清採取に使用され、年間約80万リットルのFBSが生産されている。この採血プロセスでは、母胎から胎児を取り出し、未凝固の血液を含むため、鼓動する心臓に直接注射器で無菌的に採血する必要があり、胎児が意識的に痛みを感じることが懸念されている(van der Valk et al. 2018)。このように、無血清製剤（後述）の探索は、培養肉産業および一般的な動物福祉の懸念と一致しており、科学における動物実験または動物性製品の置き換え、削減、または洗練によって明らかにされている。

細胞培養液に関する次のシリーズでは、それをほぼ普遍的な細胞培養サプリメントにした血清の成分と、血清を置き換えるための今日までのアプローチを探求する。

栽培肉学ディスカッションシリーズIV：細胞培養液、パートB

血清組成

シリーズIVのパートAに記載されているように、血清は、細胞の増殖および増殖をサポートする血液に由来する高タンパク質含有混合物である。ウシ胎児血清（FBS）は、細胞培養において最も一般的に使用されている動物血清サプリメントです。しかし、FBSは、その高コストと既知の問題点に見合う、ほぼ万能に近い細胞培養サプリメントになるように正確に何が含まれているのでしょうか？前述のように、FBSの真の組成は可変であり、未知である。培養肉に使用される種および細胞タイプの範囲にわたって異なる役割を果たす可能性のある各成分の機能について推測することは、ここでの議論の範囲外である。したがって、シリーズIVパートAで説明した基底培地のためのアプローチと同様に、ホルモン、主要タンパク質、脂質、成長因子、および微量元素を含むいくつかの成分の一般的な役割のみが以下で議論されている。

ホルモン

ホルモンは、様々な構造形態（タンパク質、ステロイドなど）を持つ内分泌シグナル分子の一群である。ホルモンは、循環系を経由して移動し、離れた組織間のコミュニケーションを媒介している。ホルモンは、したがって、胎児の子牛から採取されたときに妊娠関連のホルモンが豊富に含まれているのは当然のことながら血清中に発見されている。FBSの成分として記載されている一般的なホルモンは、インスリン、コルチゾール、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、トリヨードサイロニン（T3）、サイロキシン（T4）、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、プロゲステロン、プロラクチン、黄体形成ホルモンが含まれている。ほとんどのホルモンは、細胞表面または細胞質内にある受容体と結合することでその作用を媒介し、そこで遺伝子発現、代謝、成長などを調節するシグナル伝達カスケードをキックスタートさせます。しかし、一部のホルモンは特定の細胞タイプにしか作用しない。例えば、卵胞刺激ホルモンが培養細胞の大部分（卵巣や精巣由来の細胞株を除く）に影響を及ぼすことは考えにくい。

単一成分の単独または組み合わせの添加を介してＦＢＳの必須成分を発見するように設計された実験では、細胞培養におけるインスリンの必須の役割が、細胞内のグルコースの輸送およびグルコース代謝を調節することがすぐに明らかになった。甲状腺由来のホルモンもまた、主にこれらの経路を支配する主要な転写因子またはインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）などの成長因子の発現を調節することにより、様々な組織における細胞増殖および増殖プログラムに影響を与え得る(Näntö-Salonen et al. 1993)。他のホルモンは、必要に応じて外因性に添加することができる。例えば、デキサメタゾンのようなコルチコステロイドを可溶性複合体として細胞培養培地に直接添加してもよいし、または組換え成長ホルモンを細胞増殖および成熟を促進するために使用してもよい。特筆すべきことに、ホルモン欠乏性ＦＢＳは、所望であれば、木炭ストリッピングによって得ることができる。インスリンを除いて、ＦＢＳ中に現れる多くのホルモンは、一般的に無血清培地製剤には添加されず、それらの作用は、代わりに、それらが調節する下流の成長因子（後述）によって直接置換される。

アルブミン、フェトゥイン、トランスフェリン

FBSは高濃度のタンパク質を含み、一般的には1ミリリットルあたり30～45ミリグラムと報告されている。FBS中に見られるタンパク質アルブミン、トランスフェリン、およびフェツインは、細胞培養において特に重要な役割を持っている。アルブミンはFBSの中で最も豊富なタンパク質であり（全タンパク質含有量の50～60％）、主に様々な小分子、ビタミン、脂肪酸、コレステロール、金属イオン（亜鉛、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、ニッケルなど）の担体または安定化剤としての役割を果たしており、これらは複数の場所でタンパク質に直接結合することができます(Francis 2010)。分子を酸化から保護したり、酸化反応に参加しないようにすることで抗酸化作用を発揮する。これは、高い代謝率、溶存酸素、遷移金属（例えば、第一鉄イオンや第一鉄イオン）が有害な活性酸素種を産生する可能性があるバイオリアクター環境において特に重要である。アルブミンはまた、メカニズムはあまり理解されていないが、バイオリアクター内の細胞上のせん断応力（シリーズIIで議論）の影響を軽減することが示されている(Francis 2010)。絶対に必要ではないが、アルブミンは細胞培養培地の重要な構成要素であり、アルブミンの組換え形態は、しばしば無血清製剤で補充されている（後述）。

フェトゥイン-Aは、肝臓で合成・分泌されるキャリアタンパク質であり、FBS中に最も豊富に含まれるタンパク質の一つです（～20 mg/mLまで）(Kundranda et al. 2005)。生体内では、このタンパク質は主に異所性石灰化を防ぐためにカルシウムとリン酸塩を結合する役割を果たしているが、その後、様々な機能を持つことが理解されている(Nangami et al. 2013)。 例えば、フェチュイン-Aは、細胞の接着および拡散因子であると考えられており、in vitroで様々な基質への細胞の接着に重要な役割を果たし、細胞が二次元表面上で拡散することを可能にしているが、これは、増殖に関与するPI3kinase/Aktシグナル伝達経路を誘発する役割を媒介している可能性が高い(Sakwe et al. 2010; Kundranda et al. 2005)。また、いくつかの幹細胞培地で使用されている一般的な成長因子であるトランスフォーミング成長因子β（TGFβ）シグナ リングに対するアンタゴニストとしても機能します(Szweras et al. 2002). フェトゥイン-A は、無血清製剤には使用できないと考えられていますが、その付着および増殖誘導特性は、培養肉の研究者にとって魅力的なものになるかもしれません。実際、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンなどのＦＢＳ中に見られる他の付着因子は、すべて、細胞培養用途で精製基質として一般的に使用されている。

図1に示すように、鉄のホメオスタシスは、細胞内で鉄分を放出するトランスフェリン蛋白質との結合を伴う。鉄の恒常性には、エンドサイト化されて細胞内に鉄分を放出するトランスフェリン蛋白質に鉄が結合することが関与している。鉄分を含まないトランスフェリンは、その後、アポトランスフェリンとして細胞外空間に戻される。 Image source.

トランスフェリンは、第二鉄（Fe3+）の制御、輸送、および細胞への送達を補助するタンパク質のグループである（血清トランスフェリンについてはここで特に論じている）(Baker, Anderson, and Baker 2003)。鉄は多くの細胞プロセスに関与しており、代謝、DNA合成と修復、および生体内でのヘム媒介酸素輸送に関与するタンパク質や酵素の補因子として機能している(Puig et al. 2017)。欠乏するとアポトーシスを引き起こし、過剰になるとフェントン反応を介して生成される活性酸素種の毒性蓄積を引き起こす可能性があるため、細胞内でのトランスフェリンのレベルは厳密に制御されなければなりません(Thomas et al. 2009). トランスフェリンは、2つの超高親和性の鉄イオン結合ポケットでこの調節を媒介する。連続した鉄イオンが結合すると、トランスフェリン受容体に対する親和性が増加する。これにより、2つの鉄と結合したトランスフェリンがそれらの受容体と複合体を形成し、その結果、フェリチンのような細胞内キャリアへの鉄分の送達が可能になります。鉄を含まないトランスフェリン（すなわち、アポトランスフェリン）は、その後、血清または細胞培養培地中の遊離鉄の消去を再開するためにリサイクルすることができる。ＦＢＳは、鉄およびタンパク質複合体鉄の豊富な供給源であり、これは、妊娠中に濃度が増加する(Kakuta et al. 1997)。血清の非存在下では、第一鉄および／または第一鉄は、典型的には、基底培地中の硫酸塩または硝酸塩として送達され、組換えトランスフェリンは、鉄の恒常性を調節し、酸化的損傷を防止するために遊離鉄をスカベンジするために添加される。

脂質

脂質は、非極性溶媒に可溶な化合物の広いクラスである。細胞培養に関連する脂質は、脂肪酸およびその誘導体（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、脂溶性ビタミン（前に議論した）、およびグリセリド（すなわち、脂肪酸の貯蔵形態）が含まれている。タンパク質の含有量と同様に、FBSの脂質含有量も、どのような分子が存在しているかとその比率の両方の点で変化します。いくつかの脂質分子は、複数の血清成分間の非常に複雑な相互作用のために、生体外での役割がどのようなものであるかという点で、まだ十分に理解されていません。FBSの主要な脂質成分を以下に説明する。

図2. 脂肪酸輸送のための様々なメカニズムが提案されている。(1)受動的な拡散、(2)拡散速度の増加のためのFABPpmを介した局所濃度の増加、(3)キャリアタンパク質を介した能動的な輸送、(4)迅速な代謝を目的とした脂肪酸の能動的な輸送、(5)FATP1を介した超長鎖脂肪酸の輸送。 From Schwenk et al 2010.

脂肪酸は、カルボン酸の頭と、長さの異なる長い分岐していない炭化水素の尾から構成されている。それらは、炭素-炭素二重結合の存在（不飽和）または不在（飽和）に応じて、飽和または不飽和のいずれかであることができます。貯蔵脂肪のビルディングブロックとしての役割に加えて、彼らは膜にタンパク質をターゲットに使用することができ、膜リン脂質と糖脂質を形成し、ホルモンやエイコサノイドなどの他のメッセンジャーを導出する。生体内の循環脂肪酸の大部分（>99％）は、血清アルブミンなどのタンパク質キャリアに結合し、まだ調査中のメカニズムを介して細胞に入る（図2）。脂肪酸は、遅いが定義された速度でアルブミンから解離し、結合していない脂肪酸は、細胞表面上の特殊なトランスポータータンパク質（例えば、CD36、FABPpm、FATP1–6）を使用して受動的な拡散または促進された輸送を介して細胞内に取り込まれた後、下流での使用のために細胞質の脂肪酸タンパク質キャリア（例えば、FABPc）に結合されると考えられている(Schwenk et al. 2010)。生理的アルブミン濃度の下では、この解離および取り込みは、未結合脂肪酸の可飽和機能として起こるが、より低い濃度では、送達はアルブミン濃度に依存する(Sorrentino et al. 1989; Alsabeeh et al. 2018)。

図3. 食事中のα-リノレン酸とリノレン酸は、エイコサノイドとして知られる様々なシグナル伝達分子に代謝されます。 Tsoukalas et al. 2018.

血清アルブミンは、飽和および不飽和脂肪酸の豊富だが可変量を含むFBS中の脂肪酸含有量を運ぶための同様の役割を果たします。しかし、アミノ酸とは異なり、脂肪酸の大部分は解糖前駆体から合成することができます。試験管内でのこの合成は、細胞培養培地へのビオチン（ビタミンB7）の添加に依存している。ヒトおよび他のほとんどの動物において必須と考えられている脂肪酸は、α-リノレン酸（ALA、オメガ3脂肪酸）およびリノール酸（オメガ6脂肪酸）の2つだけである（図3、Morimoto et al. 2005)。 従って、難問は、癌細胞株培養に一般的に使用されている脂質フリーのＲＰＭＩ-１６４０基底培地(Whitford and Manwarin.; Wu and Näär 2019). これは、癌細胞株における代謝変化に起因する可能性があるが、血清の添加または脂肪酸の添加カクテルは、生合成負荷を軽減し、細胞増殖、性能、または他のパラメータを高めることができるが、ほとんどのインビトロ細胞培養用途には必ずしも必須ではないと広く考えられている。いくつかの細胞株（例えばハイブリドーマ）では、エタノールアミンなどの脂質への追加添加前駆体が必要である(Murakami et al. 1982).

しかしながら、一般に、脂肪酸の必要量は、細胞株およびタイプに依存し、最適化された培養肉生産のために経験的に決定される必要があるであろう。脂質低下FBSは、実験的要件の決定を助けるために、木炭ストリッピングまたは有機溶媒沈殿に続いて購入することができる(Alsabeeh et al. 2018)。細胞培養培地中に送達された脂肪酸に基づいて、または代謝に焦点を当てた遺伝子工学的戦略によって、栄養目的のために培養骨格筋および脂肪細胞の脂肪酸プロフィールを調整するための多くの可能性も存在する（シリーズVで議論されている）。

コレステロール

コレステロールは、ステロイドホルモンやビタミンDの前駆体であると同時に、細胞膜の重要な構造成分でもあるステロール脂質です。コレステロールは、細胞内では、異なる膜区画の間で異なる比率で分布しており（細胞膜の約30％がコレステロールである）、膜の透過性を低下させたり、膜の硬さを調整したりする役割を果たしています（図4）。コレステロールの生合成に加えて、細胞は血清中のコレステロール担持リポタンパク質の受容体を介したエンドサイトーシスによってコレステロールを得ることができます。リポタンパク質は、コレステロールやトリグリセリドのような疎水性化合物を、アポリポタンパク質と呼ばれる親水性タンパク質に囲まれた水または血清中で輸送することを可能にする。リポタンパク質は、両方ともコレステロールを含むが、その密度とサイズ（例えば、高密度リポタンパク質（HDL）、低密度リポタンパク質（LDL））によって認識される口語である。FBSでは、コレステロールは豊富（〜300μg/mL）であり、リポタンパク質複合体内に含まれ、記載されているようにインビトロで細胞に送達される。脂肪酸と同様に、細胞がコレステロールを合成する能力は、それを非必須成分にします。しかし、コレステロールの添加は、他の細胞のパフォーマンスパラメータに改善するために代謝負荷を軽減することができます。

図4 コレステロールの親水性水酸基と疎水性尾は、リン脂質膜に溶け込むことを可能にします。コレステロールの親水性水酸基と疎水性尾部により、リン脂質膜に取り込まれる。コレステロールは膜生理に重要な役割を果たしている。 Source.

成長因子

成長因子は、それぞれの受容体に結合した後にシグナル伝達カスケードを開始することで、成長、増殖、分化を刺激するシグナル伝達分子の広いクラスです。それらは、ほぼ普遍的な成長サプリメントとしてのFBSの成功のための最も重要な理由であることは間違いありません。いくつかの成長因子（例えば、ホルモン）はすでに記載されている。ここおよび今後のセクションでは、組換え法で生産することができるタンパク質ベースの成長因子に焦点を当てる。限られた公開情報は、タンパク質の数とその可変量(Zheng et al. 2006)のためにFBSの完全な個々のタンパク質の化粧を取り巻く存在している。アルブミンやフェチュインなどのタンパク質と比較して、成長因子は一般的に100万倍以下の濃度（ng/mLの範囲）で発見され、正確な定量や検出が困難である。これらの量は、胎児環境が成長刺激のために濃縮されているので、実際には、成人の体内で発見されたよりも高いかもしれません。少数の利用可能な報告は、FBSで見つかった典型的な成長因子は、インスリン成長因子ファミリー、線維芽細胞成長因子ファミリー、トランスフォーミング成長因子ファミリー、およびニューレグリンファミリー(Zheng et al. 2006).のメンバーが含まれていることを示している。これらのファミリーからのいくつかの特定のタンパク質の役割については、後のセクションで詳しく説明します。

ヘパリン

ヘパリンは免疫マスト細胞で産生されるグリコサミノグリカンです。ヘパリンは、生体内でアンチトロンビンIIIと結合して活性化し、下流の抗凝固作用につながる抗凝固剤としての役割が最もよく知られている。しかし、エビ、ロブスター、アサリなどの凝固系を持たない無脊椎動物におけるヘパリンの進化的保存は、ヘパリンのさらなる役割を示唆している(Medeiros et al. 2000). 無脊椎動物のヘパリンの中には、哺乳類で使用されると抗凝固特性を保持するものもあるが、その役割は免疫機能の調節にあるのではないかと推測されている(Medeiros et al. 2000)。

幹細胞培養の用途では、ヘパリンは線維芽細胞増殖因子ファミリー（FGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）ファミリーの一部と結合する(Spivak-Kroizman et al. 1994; Andrae et al. 2013)。この結合は、細胞の種類およびどの成長因子が培地製剤に含まれるかに応じて、細胞増殖に対して刺激的または抑制的な効果を有し得る。さらに、ヘパリンと構造的に類似しているヘパラン硫酸プロテオグリカンは、細胞外マトリックス中で成長因子を結合して隔離することができる（シリーズIIIパートAで議論されている）。したがって、ＦＢＳ含有媒体中のヘパリンは、成長因子との相互作用により、幹細胞増殖に複雑な影響を及ぼす可能性がある。培養肉に使用される無血清製剤にヘパリンが含まれる可能性は、培地製剤に含まれる細胞タイプと特定の成長因子に依存すると思われる。

微量元素（ミネラル

ミネラルは、細胞内で生化学的機能を有する化学元素である（図５）。先にシリーズIVパートAで取り上げたイーグルのミニマム必須培地に含まれる6つの無機塩には、一般的に人体の5大ミネラルとされるカルシウム、カリウム、マグネシウム、リン、ナトリウムの元素が含まれている。体内で生化学的な役割を持つ他の元素（酸素、炭素、水素、窒素以外の元素）は、微量に検出され、微量元素を構成している。硫黄、鉄、塩素、クロム、コバルト、銅、亜鉛、マンガン、モリブデン、ヨウ素、セレンなどです。微量元素は、ホルモンの生成や機能から、アミノ酸、グルコース、脂質代謝の酵素の補酵素に至るまで、細胞や特定の組織において様々な重要な機能を持っている。細胞は微量元素のレベルに非常に敏感であり、微量元素の量が少ないと欠乏につながり、多いと毒性があることが多いからです。主要元素と微量元素の役割と要件は、一般的に養殖肉や魚介類に関連する種全体で保存されている。これらの微量ミネラルは、純粋な元素としてではなく、化合物または複合体の形態で存在するFBS(Bryan et al. 2011)を補充することにより、細胞培養で容易に得ることができる（例えば、コバルトは、ビタミンB12の化学名であるコバラミンとして得られる）。微量元素は、無血清製剤の重要な構成要素であり続けるだろう（後述）。

図5. 周期表での栄養元素。Wikipedia.

セレンとグルタチオン

セレンは、1970年代の実験でFBSの必須微量元素成分であることが発見されました(Yao and Asayama 2017)。セレンは、それぞれ過酸化水素とチオレドキシンの還元を介して酸化ストレスを調節する酵素であるグルタチオンペルオキシダーゼやチオレドキシン還元酵素などの進化的に保存された酵素の補酵素としての役割を果たします。血清中では、グルタチオンペルオキシダーゼなどのセレノタンパク質に取り込まれ、その構造中にセレノシステインと呼ばれるセレン含有システイン類似体を含む。セレンタンパク質Pは、最も重要な血清セレンタンパク質の一つであり、血清セレンの50％まで運ぶ(Tujebajeva, Harney, and Berry 2000)。セレンは、陰イオン輸送体を介して無機セレンとして、アミノ酸輸送体を介してセレノアミノ酸として、または受容体媒介エンドサイトーシスを介してセレノプロテインPに複合体として、細胞によって取り込まれることができる(Nickel et al. 2009; Burk and Hill 2009)。無血清製剤では、セレンは、典型的には、インスリン-トランスフェリン-セレン併用サプリメントの一部として亜セレン酸ナトリウムとして送達される（後述）。

グルタチオンペルオキシダーゼは、酸化還元反応のための電子の供給者としてセレノシステインを含むグルタチオンを使用して過酸化水素および脂質過酸化物の還元を触媒する(Arteel and Sies 2001)。さらに、グルタチオンは、ビタミンCの再生経路における還元基質として機能する(Foyer and Noctor 2011)。このように、グルタチオンは重要な細胞抗酸化物質である。それは、ほとんどの動物細胞によって生合成することができ、水溶性であり、それは常に細胞の成長を維持するために不可欠な成分ではありませんが、その還元型および混合ジスルフィド形態でFBS中に豊富に見出されます(Bump and Reed 1977)。

細胞外小胞

細胞外小胞は、一部の細菌、真菌、植物を含む、すべての細胞タイプではないにせよ、ほとんどの細胞タイプから放出される膜コーティングされた小胞構造体です（図6）。これらの小胞は、一般的に10nm～1µmの間の不均一な大きさで、エンドソーム系（エクソソソームなど）に由来するか、形質膜から放出されます（マイクロベシクルなど）。それらは核酸、タンパク質、脂質などのカーゴを含み、生体液中に排泄され、細胞内コミュニケーションの重要な形態となっている(van Niel, D’Angelo, and Raposo 2018)。細胞外小胞は、ＦＢＳ中に多量に見出され、異なる細胞タイプに対して可変的な効果を有する複雑で可変的なカーゴの組成を有する。これは、ＦＢＳの使用に起因する変動性を考慮する場合、重要な追加の複雑さの次元を追加する。

細胞外小胞は、超遠心分離または他の濾過および捕捉技術を用いて流体から単離することができ(Li et al. 2017)、その結果、エキソソームが枯渇したFBSが得られる。正常なＦＢＳと比較して、エキソソームを欠失させたＦＢＳは、多くの細胞株にわたる細胞増殖の減少をもたらし(Eitan et al. 2015)、骨格筋細胞における増殖および分化の変化をもたらし得る(Aswad, Jalabert, and Rome 2016)。FBS由来の細胞外小胞を単独で添加すると、これらの表現型のいくつかを復元することができ、細胞培養におけるそれらの重要性を実証する(Eitan et al. 2015).。細胞外小胞のカーゴを理解し、その成分が特定の細胞型にどのように影響するかを理解することは、したがって、増殖、分化、または成熟を補助するなどの培養肉用途で追求するのに有用であるかもしれない(Forterre et al. 2014)。

図6 細胞外小胞には、細胞膜から排出されるマイクロベシクル（MV）と、エンドソーム由来のエクソソソームがあり、細胞外小胞には、細胞膜から排出されるマイクロベシクル（MV）と、エンドソーム由来のエクソソソーム（エクソソソーム）があります。細胞外小胞には、細胞質膜から流出したマイクロベシクル（MV）とエンドソーム系由来のエキソソソームが含まれる。アポトーシスボディ(AB)は大きさが著しく大きく、議論の対象にはならない。細胞外小胞は、標識された（１）〜（４）の様々な受信メカニズムを介して標的細胞の挙動を調節することができる。. From Doran, Zhang, and Vidal-Puig 2017.

既存の血清代替品の従来例

ＦＢＳのより詳細に説明し得るより多くの特定の成分が存在するが、前者の議論は、無血清製剤に含めることが考慮される可能性のある成分を考慮して、重要なＦＢＳ成分の大部分をカバーする。血清を置換するための広範な努力が試みられ、達成されており、これらの置換物の多くは今日使用されており、様々な用途での無血清細胞培養を可能にしている。しかしながら、無血清製剤は、培養肉に特化してさらに最適化する必要があるだろう（シリーズIVのパートCで議論する）。

このセクションでは、幹細胞培養で考え出された、あるいは積極的に利用され ている既存の血清置換戦略のサブセットを探っていく。これらの例は、現在の血清置換法がどのようなものか、また新しい置換法につ いて何を教えてくれるのかについての理解を深めるのに役立つものにすぎな い。これらの例の議論は、それらが他の既存のFBS代替品と比較して培養肉に多かれ少なかれ適していることを意味するものではありません。

血小板溶解物

血小板は血液の構成要素であり、血液の凝固、創傷治癒、一般的な免疫機能を助けます。血小板は、様々なケモカイン、成長因子、および溶解によって放出される接着タンパク質を保持している。1.5–4.5×10⁵/μL）とアフェレシス後の血小板を濃縮するための標準的なプロトコルを介して達成可能な血液中のその豊富さのために、ヒト血小板溶解物は、1980年代以降のin vitro細胞増殖のために使用されている。血小板溶解物は、成長因子（図7）、アルブミン（20–36 mg/mL）、ビタミン、ミネラル、脂質のアルブミンの典型的なカーゴ、免疫グロブリン、およびグルコースとコレステロールのようなタンパク質を豊富に含んでいる。したがって、血小板溶解物は、ＦＢＳと非常に類似しているが、より高い免疫グロブリン含量を有し、トロンビンを用いて活性化せずに生成された場合には、フィブリノーゲンのような凝固因子を含むことがある(Burnouf et al. 2016)。

図7. ヒト血小板溶解物は、培養肉生産に関連する様々な重要な成長因子（シリーズ４Ｃでさらに議論されている）を含んでいる。 From Burnouf et al. 2016.

血小板溶解物は、様々な方法を用いて血小板を濃縮し、次いで、繰り返しの凍結融解サイクル、トロンビンまたは塩化カルシウムを用いた活性化、超音波処理を介した破裂、または溶媒および洗浄剤処理を介した溶解によって得られる。ライセート調製の上流の方法が、最適化された下流の性能とどのように関連しているかは現在のところ不明であるが、それでも、主にヒト間葉系幹細胞を使用した多くの研究では、複数の基準でFBSに対する血小板ライセートの性能が改善されたことが報告されている（図8、Burnouf et al. 2016）。例えば、FBSを血小板溶解物で代用すると、ヒト間葉系幹細胞において、集団の倍数化時間を有意に減少させ(Ben Azouna et al. 2012) 、複数の倍数化にわたって総アウトグロウを増加させることが示されている(Schallmoser et al. 2007) 。これらの効果は、骨格筋芽細胞を含む他の幹細胞タイプにおいても再現されており(Saury et al. 2018)、血小板溶解物は、他の多くの幹細胞タイプにおいてFBSと同様の方法で一般的な細胞増殖をサポートしている(Burnouf et al. 2016)。ヒト細胞がヒト由来の血小板溶解物中で良好なパフォーマンスを示すことは、おそらく驚くべきことではなく、この改善されたパフォーマンスは、血小板溶解物を培養肉用途に潜在的に魅力的なものにする可能性がある。

図8. ヒト血小板溶解液（ＨＰＬ）対ウシ胎児血清（ＦＢＳ）における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の多重増殖特性の比較。 From Burnouf et al. 2016.

血小板溶解液は、FBSよりも優れた利点があるが、ヒト血小板溶解液がヒト以外の細胞でどのように機能するか（特定の動物種から血小板溶解液を入手することは、以下に述べる理由から経済的に不可能である可能性が高く、動物福祉との整合性が取れていない）など、いくつかの疑問が残っている。他の活発な研究分野としては、血小板溶解液中の免疫グロブリンA、G、Mの高含有量の役割の理解、最適な調製方法、ドナーの血液型と年齢の役割、生産、供給、品質の問題などがある。これらが明らかに非問題であったとしても、供給が限られているため、培養肉への使用に支障をきたす可能性が高い。ヒト血小板溶解液の商業的な販売業者は、米国と欧州で設立されている。しかし、ヒト血小板溶解液の現在の価格は、1/2リットルあたり1000ドルを超え、FBSよりも高価である。理論的には、生産能力がスケールアップして価格が下がる可能性がある。例えば、全血献血からの血小板濃縮物の5～20％は、5～7日の保存期間中に期限切れになると推定されており、これらの血小板濃縮物は凍結して細胞培養用途に使用することができ、世界的に10万～25万リットルの血小板濃縮副産物産業を開く可能性がある(Burnouf et al. 2016)。これは無駄になった副産物を考慮に入れているだけなので、献血や採血の際に血小板濃縮物を回収することにもっと力を入れれば、この数は需要に応じてかなり簡単に増加する可能性がある。

血小板溶解液のもう一つの生産方法は、大量の血小板を作り出す免疫細胞であるiPSC由来の巨核球を介したものである。巨核球系統への分化の最近の進歩により、インビトロでは、インビボの対応するものと比較して増加した成長因子含有量を含む血小板を作製することが可能になる(Strassel, Gachet, and Lanza 2018; Baigger et al. 2018)。 にもかかわらず、ヒト細胞を成長させて、培養肉産業のために手頃な価格で販売される製品を作ることを想定するのは困難である（シリーズIVパートCでさらに議論される）。さらに、ヒト患者の血小板に対する需要が高いことから、iPSC由来の血小板溶解物製品は、臨床使用のために高い価格帯で販売され、おそらく流通業者が培養肉産業に低価格でサービスを提供する理由があれば、それに負けてしまうだろう。

これらを総合すると、安全性を確保するために必要な上流工程と品質管理、特に採血された血小板の場合に何百ものドナー検体をプールする場合には、ヒト血小板溶解液は、規模の大きい培養肉には経済的に不可能なものとなる可能性が高い。それにもかかわらず、血小板溶解物のユニークな組成およびそこに含まれる成長因子についての理解が深まれば、より経済的な方法を用いて製造された新しい製剤の作成に活用することができる（後述）。

培養上清

培養上清とは、細胞増殖期間後の使用済みの細胞培養培地を指す用語である。したがって、成長因子、代謝物、サイトカイン、細胞外小胞、細胞外マトリックス蛋白質など、時間の経過とともに培地に蓄積された分泌されたすべての因子が含まれます。培養上清の収穫は、様々な種類の幹細胞の増殖に使用されており、さらには潜在的な無細胞治療法としても使用されている(Pawitan 2014)。特定の細胞型からの培養上清は、同じ細胞型を増殖させるために使用することもできるし、全く異なる細胞型を完全に増殖させるために使用することもできる。

条件付培地はまた、細胞増殖に必要な成長因子を三角測量するために使用することができる。例えば、ヒト胚性幹細胞培養の開発中に、マウス胚性線維芽細胞を「フィーダー」細胞として使用することは、時間の経過とともに多能性の維持をサポートするのに十分であることが判明し、線維芽細胞を除去することは分化をもたらした(Thomson et al. 1998)。これらのマウス胚性線維芽細胞から分泌される特異的な成長因子およびサイトカインの研究は、最終的に多能性幹細胞のための細胞培養培地製剤の開発につながった(Desai, Rambhia, and Gishto 2015)。今日でも、マウス胚性線維芽細胞培養培地は、多能性幹細胞培養のための一つの選択肢として販売されている。

図9. 培養肉会社のFork and Goodeによる特許出願の画像で、様々な独立して培養された細胞タイプからのコンディショニング培地が、相互に接続されたバイオリアクター全体にポンプで送られるシステムを説明している。 Source.

しかし、この方法は必ずしも一筋縄ではいかない。筋芽細胞のような単一細胞型の分泌物には数百のタンパク質が含まれており、それらのタンパク質は独立して、あるいは協調して作用して効果を発揮することがある(Henningsen et al. 2010)。さらに、分泌因子の中には、細胞の成長や分化などの所望のプロセスを阻害するものもあり、それらの影響を防ぐためには、完全に除去するか、あるいは十分に低いレベルに保つ必要があるかもしれない(Csaszar et al. 2012)。培養肉生産に使用されている、研究が進んでいない多くの種や細胞型の分泌物を理解するためには、相当な研究が必要であろう。

それにもかかわらず、培養肉用の細胞を成長させるために培養上清を使用する類似の戦略が考え出されている。例えば、日本の新興企業Intricultureは、CulNetと呼ばれるシステムの特許を出願しており、これは、異なるグループの細胞に餌を与えるために培養上清を生成する一連の相互接続されたフィーダー細胞を記載している(羽生 and 川島 2018) 。同様の培養上清システムは、培養肉会社のFork and Goodeによって出願されている（図９、Forgacs and Gupta 2019）。そのような戦略は、細胞増殖を補充し、新しい細胞株のための成長因子要件の発見を支援するのに十分であるかもしれないが、細胞増殖を補充する手段として複数の細胞タイプを増殖させることの手頃さ対、より費用対効果の高い方法（後述）を介して重要な成長因子を単に生産することの手頃さは、和解するのが難しいかもしれない。

単一タンパク質溶液 — セリシン

FBSと同様の方法で細胞の成長と増殖を刺激することができる単一のタンパク質を使用することは、コストと使いやすさの観点から有利であると考えられる。セリシンは、カイコであるBombyx moriによって生産される絹の2つの主要なタンパク質構成要素の1つです。それは絹織物産業の副産物と考えられていますが、しかし、そのユニークなアミノ酸組成、親水性、および生体適合性は、生物科学や生物医学における潜在的な使用例をもたらします(Aramwit, Siritientong, and Srichana 2012)。細胞培養において、セリシンの添加は、様々な哺乳類細胞株の増殖（図10、Liu et al. 2016; Terada et al. 2002）、哺乳類細胞の付着(Tsubouchi et al. 2005)、および拡散(Martínez-Mora et al. 2012)を支援してきたが、これらはすべてFBS補充の重要な資質である。これらの結果は、筋芽細胞 (Fujita et al. 2010) や昆虫細胞(Takahashi et al. 2005) のような他の細胞種にも拡大している。セリシンの増殖性のメカニズムを詳細に調べた研究はほとんどなく、これらを判断するためにはさらなる研究が必要である。とはいえ、セリシンのような単一のタンパク質の成功は、培養肉用途で FBS 置換に使用できる類似の生物学的特性を持つ他のタンパク質の発見につながる可能性を秘めている。

図10。セリシン（30μg/mL）を補充した培地は、3つの異なる細胞株にわたってコントロール（10％FBSを補充した培地）と比較して、改善された集団倍増時間を示した。 From Liu et al. 2016.

ノックアウト血清置換

トランスレーショナルヒト胚性幹細胞研究は、培養肉産業が現在取り組んでいるように、FBS含有に関連する同じ問題の多く（シリーズIVパートAで議論されている）を扱ってきました。ノックアウト血清置換は、胚性幹細胞のような単一の細胞型のための培地中のFBSを置換する試みの一例である。その組成は、可変脂質含有量のために化学的に不定である（後述）が、バッチからバッチへの比較的一貫性がある。その成分リストは、１２種類のアミノ酸（必須および非必須の両方）、酸化防止剤（ビタミンＢ１、還元型グルタチオン、ビタミンＣ）、１９種類の微量元素、およびトランスフェリン、インスリン、および脂質リッチアルブミンを含む(J, D, and Lynn 1998)。適切な基底培地製剤および添加された成長因子とともに使用される場合、ノックアウト血清置換は、胚性幹細胞の自己再生を刺激し、ＦＢＳと同様の方法で、しばしば改善された方法で多能性を経時的に維持することができる。したがって、ＦＢＳ中に見出される成分の特定のセットを含めることは、その多くが以前に議論されてきたように、ＦＢＳ置換のための十分な戦略を提供し、化学的に定義された媒体の処方を通してＦＢＳを置換するために行われてきた仕事の大部分についての議論のための基礎を築くことになる。

次のシリーズでは、無血清培地製剤の作成、および培養肉の商業化に必要な様々なコスト削減戦略を取り上げます。

培養肉科学ディスカッションシリーズIV：第D部「魚介類用細胞培養液

Contributed by クレア・ボムカンプ、Ph.D.

序章

胚性などの系統からの水生動物細胞株の樹立と研究は成功しているが、陸上脊椎動物からの細胞培養に比べて、この分野はまだ黎明期にある。特に、水生動物については、培地組成の本格的な最適化が行われていない。ここでは、養殖魚介類の生産に適した動物性成分を含まない最適化された製剤において、どのような成分が必要とされる可能性が高いか、あるいは必要とされない可能性が高いかについての洞察を得るために、水生種からの過去の細胞培養研究について論じている。水生種と陸生種の生体内栄養所要量と食肉組成の比較も参照されているが、in vivo と in vitro の特性の間の翻訳可能性が限られている可能性があるため、このような比較は本質的に定性的なものであると考えるべきである。

培地組成は、魚胚性幹（ES）様細胞、他の魚の細胞、および甲殻類からの細胞のために別々に考慮されている。ES様細胞という用語が使用されているのは、いくつかの系統が複数のESCマーカーを発現し、胚様体を形成するような他の幹細胞様の特徴を示すことが示されている一方で、他の系統はあまり完全に特徴付けされていないからである。ES様細胞は、ESCと部分的に分化している可能性のある他の細胞の両方を含むと理解すべきである。

水生種のために培地を最適化することは容易な問題であり、陸生種からすでに得られている多くの研究によって容易になっている。しかし、テレポスト魚類、甲殻類、その他の水生生物種のために様々な成分の濃度を系統的に最適化するためには、まだ多くの研究が必要である。特定の種や細胞タイプに合わせて培地組成を微調整するためには、さらなる最適化が必要である。最適化のための具体的な戦略については、シリーズIVのパートCで検討した。

魚類と哺乳類からのES様細胞のための培地の比較

哺乳類の細胞培養に比べて、魚類細胞の培養環境についてはあまり知られていない。魚のES様細胞株を培養するために使用される最も一般的な培地製剤は、もともとメダカ細胞、研究モデル生物として一般的に使用される小魚のために開発されたものである(Hong, Winkler, and Schartl 1996)。原著ではESM1と呼ばれているこの製剤は、ウシ胎児血清（FBS）だけでなく、魚血清および魚胚抽出物も含んでいる。2つの組換えヒト成長因子、FGF2（bFGFとしても知られている）およびLIFも同様に含まれている。ヒトESCおよびiPSC培養のために最適化された無血清エッセンシャル8（一般にE8として知られている）(G. Chen et al. 2011) およびB8(Kuo et al. 2020) 配合物とESM1およびその誘導体の一部を比較すると、いくつかの類似点および相違点が明らかになる（表1）。

表1. 魚のES様細胞を培養するために使用されるE8、B8、およびいくつかの培地製剤の比較。横線で区切られていない成分は、類似の機能を果たしているか、類似の受容体やシグナル伝達経路と相互作用しているため、互いに代替する可能性が高い成分である。太線は、この成分の魚細胞増殖に対する効果を直接試験し、正の効果が認められたことを報告した論文であることを示している。二重ボーダーは、TGFβの本質性は長期成長アッセイでのみ明らかになるが、単なる成長促進ではなく、必須であることが示された成分（基底培地以外）を示している（Kuo et al. 2020） β-メルカプトエタノール、セレン、FGF2、FBS、および魚血清のカラースケールは、製剤間の濃度差の可視化を容易にする。疑問符は、報告された成分の濃度が公表されていないことを示している。B8 培地製剤では、耐熱性バリアントである FGF2-G3 を使用しているため、培地中の有効濃度は他の出版物と比較して表示されているよりも高い可能性があることに注意してください。抗生物質および緩衝剤は示されていない。Also see (Dash et al. 2010).

すべての配合は、DMEM、L-15、またはこれらのうちの1つまたは両方とF12の混合物などの共通の基底培地に基づいており、緩衝剤、何らかの形態の抗酸化剤または活性酸素種捕捉剤、およびセレンイオンの供給源を含んでいる。これらは、同一または類似の組換え成長因子を含む。ESM1に含まれるLIFおよびE8に含まれるTGFβ/NODALは、TGFβでの処理がグリオブラストーマ細胞においてLIFの頑健な発現を誘導することが示されているように、互いに類似した役割を果たす可能性がある(Peñuelas et al. 2009)。同様に、発育中のラット腎臓からの探索物をＬＩＦまたはＴＧＦβのいずれかで処理すると、ＬＩＦの発現が誘導されるとともに、ＴＧＦβの発現の適度な増加が誘導された(Plisov et al. 2001)。B8のみに含まれるNRG1は、成長を増強するが、必須ではない(Kuo et al. 2020)。E8およびB8は、ESM1に直接アナログを持たない2つの成分：トランスフェリンおよびインスリンを含む。さらに、E8およびB8は、ESM1よりも実質的に高い濃度の亜セレン酸ナトリウムおよびFGF2を含む。ESM1は、E8およびB8とは異なり、FBS、魚血清、および魚胚抽出物を含む。これらの動物由来の成分は、トランスフェリン、インスリン、セレン、およびFGF2（またはそれらのアナログ）の供給源として機能し、したがって、最適化された無血清培地を製造するためには、これらの成分の少なくとも一部が必要とされるであろう。

表1. 魚のES様細胞を培養するために使用されるE8、B8、およびいくつかの培地製剤の比較。横線で区切られていない成分は、類似の機能を果たしているか、類似の受容体やシグナル伝達経路と相互作用しているため、互いに代替する可能性が高い成分である。太線は、この成分の魚細胞増殖に対する効果を直接試験し、正の効果が認められたことを報告した論文であることを示している。二重ボーダーは、TGFβの本質性は長期成長アッセイでのみ明らかになるが、単なる成長促進ではなく、必須であることが示された成分（基底培地以外）を示している(Kuo et al. 2020) β-メルカプトエタノール、セレン、FGF2、FBS、および魚血清のカラースケールは、製剤間の濃度差の可視化を容易にする。疑問符は、報告された成分の濃度が公表されていないことを示している。B8 培地製剤では、耐熱性バリアントである FGF2-G3 を使用しているため、培地中の有効濃度は他の出版物と比較して表示されているよりも高い可能性があることに注意してください。抗生物質および緩衝剤は示されていない。(Dash et al. 2010)も参照のこと。

魚ES様細胞の培養には何が必要ないのか？

魚のES様細胞を使用しているほとんどの出版物は、ESM1に基づいて培地配合を採用している。魚ES様細胞の無血清培養の唯一の成功例はメダカであり、IGF2とDMEMを補充することによって達成された(Yuan and Hong 2017)。この製剤は、増殖をサポートすることができたが、LIFを除いてESM1と同じ成分をすべて含む対照製剤と同様の性能を発揮せず、長期培養をサポートする能力については試験されなかった。したがって、魚類幹細胞培養に最適化された培地を特定するための重要なステップは、アニマルフリー培地で魚類幹細胞を最適に増殖させるために必要かつ十分な血清と胚抽出物の追加成分を特定することである。天然に存在する血清の組成物は、本シリーズIVのパートBに詳細に記載されている。血清の非存在下での魚ES様細胞の頑健な成長をサポートすることができる成分のセットの同定は、いくつかの候補の慎重な試験と、それぞれの濃度の最適化を必要とするであろう。

ESM1のいくつかの成分は、他の研究では頻繁に省略されており、したがって、最適化された動物を含まない製剤を見つける試みにおいて、おそらく優先順位を下げることができる。成長因子LIFは、元の出版物 (Hong, Winkler, and Schartl 1996) では初期の通路の間のみ使用されており、他の研究 (Ho et al. 2014; Z. Fan et al. 2017; Béjar, Hong, and Alvarez 2002; Song-Lin Chen et al. 2005; Kim et al. 2018; Parameswaran et al. 2007; Bryson et al. 2006) では最も一般的に省略されている成分の一つであり、少なくともいくつかの種または系統では必須ではない可能性があることを示唆している。インドのメジャーコイの ES に似た系統では、LIF は成長を刺激し、未分化状態を維持するのに役立つことが示されたが、他の成長因子の存在下で試験した場合、両方の効果は非常に控えめであった (Dash et al. 2010)。ESM1は、追加の栄養源としてグルタミン、ピルビン酸、および非必須アミノ酸（NEAA）を含むが、ターボット(Song-Lin Chen et al. 2005)、オリーブカレイ(Kim et al. 2018)、バラマンディ(Parameswaran et al. 2007) 、およびハドック(Bryson et al. 2006) からの細胞は、これらのサプリメントなしで培養に成功している。グルタミンはまた、スズキおよびアカメからのES様細胞の研究においても省略された(S-L Chen et al. 2003; Song-Lin Chen, Sha, and Ye 2003)、シリーズIV、パートA (Vardhana et al. 2019) で述べた哺乳類ESCのグルタミン独立性と一致している。

2つの研究は、注目すべきアウトライアスである。バラムンディ(Parameswaran et al. 2007) およびハドック(Bryson et al. 2006) からのES様細胞株は、両方とも15〜30％のFBSを用いてL-15中で正常に培養された。しかし、組換え成長因子を含む培地、魚血清、胚エキスを含む培地との系統的な比較は行われていないため、最適な増殖のためには FBS を添加した L-15 で十分であるとは結論づけられない。培養肉や魚介類になるとFBSの排除が最終的な目標となる必要があるが、一般的な食品種からのいくつかの魚ES様細胞が魚血清または胚エキスの非存在下で増殖するという事実は、魚ES様細胞が非水生細胞株の無血清培養のためにすでによく特徴づけられているのと同じ成長因子を認識し、必要としていることを示唆しているので、心強いものである。残念なことに、培養魚介類用途のために置換することが必須となる3つのESM1成分は、食品関連の魚種からのES様細胞のすべての（FBS）またはほとんどの（魚血清、魚胚エキス）研究にわたって一貫して使用されている。

血清と成長因子の必要条件

これらの成分のそれぞれの必要性がどの程度まで体系的に検証されているかは、上記の研究のほとんどで明らかになっていない。タラ(Holen, Kausland, and Skjærven 2010) における FGF2 と FBS の重要性と、ターボット(Song-Lin Chen et al. 2005) における FGF2, FBS, および魚血清の重要性は、完全な培地からこれらの個々の成分を差し引くことで実験的に実証された。逆の方法（最小培地に特定の成分を添加する方法）では、コイ ES様細胞では、NEAA とピルビン酸ナトリウムを含む基底培地に個別に添加した場合、魚胚エキスと FGF2 が最も成長をサポートする能力が高いことが明らかになったが、FBS、LIF、魚血清の効果は弱くなった(Dash et al. 2010). 魚類細胞と陸生細胞の間、および異なる種の魚類細胞の間の両方の成長因子濃度要件の違いは、これらの細胞の本質的な成長因子要件だけでなく、異なる温度での成長因子の安定性の違いに起因する可能性があります(G. Chen et al. 2012)。血清は、タンパク質、ペプチド、および他の分子の複雑な混合物であるので（シリーズIV、パートAおよびパートBで議論されているが、血清に代わることができる最小限の成分のセットを特定することは、重要な課題となるであろう。以下、魚類ES様細胞の最適な生存および増殖のために必要とされ得るいくつかの候補血清成分が議論されている。これらの多くは、哺乳類ESCの無血清培養に日常的に使用されており、本シリーズのパートBでさらに詳細に議論された。

魚類におけるインスリンおよびインスリン様成長因子の役割

ゼブラフィッシュはヒトのインスリンに反応し、高用量に曝露すると哺乳類と同様の方法でインスリン抵抗性を発現することが実証されているが(Marín-Juez et al. 2014)、魚類の幹細胞増殖に対するインスリンの効果は、これまでのところ不明である。しかし、関連するインスリン様成長因子IGF1およびIGF2は、この文脈でよりよく研究されている。適度なレベルの IGF1 補給は、線維芽細胞様ナマズ細胞株の成長の適度な増加をもたらした(Cyrino and Mulvaney 1999).。メダカESC株HX1は、上記のESM1に類似した組成の培地からDMEM単独に移行したときに、形態の劇的な変化と幹細胞マーカーの発現の損失を示した。これらの効果の両方とも、細胞をIGF2を含むDMEMに移行させたときに、大部分が救済された(Yuan and Hong 2017)。さらに、同じ研究において、IGF2を含むDMEMは、対照培地よりもわずかに効率が悪いものの、ブラストメアの導出をサポートすることができた。対照的に、IGF1は増殖を刺激する能力が非常に弱いだけで、インドの主要なコイでは未分化状態の維持をサポートすることができませんでした(Dash et al. 2010) これが IGF1 と IGF2 の違いを反映しているのか、それとも種の違いを反映しているのかは不明である。インスリンは、哺乳類のESCの増殖をサポートする能力が実証されているため、また、IGFは魚類の生存と増殖を改善する能力があるため、血清置換戦略の必 要な構成要素である可能性が高い。インスリン、IGF1、およびIGF2は、3つすべてが、実質的に異なる親和性を有するにもかかわらず、複数の受容体と相互作用し、それらの受容体特異性において重複することが知られているため、どの程度まで互いに代替することができるかは不明である(Griffeth, Bianda, and Nef 2014; Frasca et al. 1999; Andersen et al. 2017)。

図1. IGF2の量を増加させた基底培地の補充（c-f）は、血清含有培地（a）から未補充の無血清培地（b）に移行したメダカESCの形態学的変化を部分的に救済する結果となる。IGF2はまた、これらの細胞の生存性を部分的に救済する（g、AlamarBlueの平均蛍光強度、MFIとして測定される）。 From (Yuan and Hong 2017).

魚におけるトランスフェリンと鉄の役割

トランスフェリンは、遊離鉄イオンと結合することにより、魚類および他の脊椎動物の両方で鉄代謝の調節に関与している（シリーズIVパートBで議論されている）。これは、それらが活性酸素種の形成を引き起こすのを防ぎ、同時に細胞内の適切な部位での鉄の利用可能性を増加させる両方である(Asmamaw 2016).。他の脊椎動物と同様に、鉄は魚類では必須の微量栄養素である。アトランティックサーモンの食事中の鉄必要量は、肉牛に推奨されている食事の50mg/kgと同様に、食事1kgあたり60mgの鉄と推定され、鉄欠乏したサーモンは次亜色性微小球性貧血を発症することがわかった。これらの数値は生物全体に基づいており、多くの細胞タイプのニーズを反映していることに留意することが重要です。生のアトランティック・タラには100gあたり0.38mgの鉄分が含まれており、生のステーキ、1.85mg/回、または生の鶏肉よりも低く、軽い肉では0.92mg/回、濃い肉では1.22mg/回となっている。他の魚類は、生のカツオのマグロのように陸生種と比較して、1食あたり1.25mgである。鉄の必要量または蓄積量のこのような定量的な違いは、鉄に対する細胞の必要量の違い、鉄の吸収のしやすさの違い、またはこれらの2つの要因のいくつかの組み合わせを反映している可能性があります。しかし、鉄とそのキャリアであるトランスフェリンの両方が魚類と陸生脊椎動物の間で同様に動作するように見えるという事実は、異なる濃度ではあるが、それらが細胞培養培地で同様に必要とされる可能性があることを示唆している。言い換えれば、魚類幹細胞培地にトランスフェリンを添加することは有益である可能性が高い。DMEMはすでに亜硝酸第二鉄を含んでいますが、魚のES様細胞の培養のために特別に鉄濃度を最適化することも改善された結果をもたらす可能性があります。

魚類におけるセレンの必要量

セレンは、80 nMの濃度でE8培地に存在する(G. Chen et al. 2011).。この濃度は、最大増殖には十分に高くないかもしれない；E8のさらなる最適化により、116 nMの濃度でセレンが含まれるB8製剤が得られた(Kuo et al. 2020)。対照的に、２ｎＭと８ｎＭの間の濃度は、魚のＥＳ様細胞の培養に使用されており、いくつかの研究では、定義されたセレン源を全く使用していない（表１を参照）。セレンに対する細胞内の要件が魚類と哺乳類の間で異なる可能性があるので、魚類におけるセレンの要件について知られていることを検討する価値がある。セレンの要件は、サケ科魚類のために推奨される食事の0.03 mg/kgからハタの稚魚のための食事の0.7 mg/kgに、魚種間で大幅に異なる。肉牛のための推奨最小セレン投与量は、様々な魚種のために推奨される範囲内で、食事の0.1 mg/kgです。魚はまた、その筋肉内にセレンを蓄積する。生のアトランティックタラのためのセレン含有量は、生のステーキのそれよりも、100グラム当たり33.1μgで、高いですが、サービング当たり21.1μg、または生の鶏肉は、光肉、サービング当たり17.8μg、またはダーク、サービング当たり13.5μgかどうか。トランスフェリンと同様に、セレンは、陸生脊椎動物からの細胞のためのものと同様の濃度で魚の幹細胞培地のために必要とされない理由は明らかではありません。任意の魚種のための最適なレベルを特定することは、任意の血清置換戦略の一部でなければなりません。

バッファリング剤の選択

魚類 ES 様細胞株を培養する際の標準的な方法は、CO2 環境下で培養を維持し、主な緩衝剤として HEPES を使用することである（シリーズ IV パート A で説明）。ある研究では、ニワトリESCの培養はHEPESや他の双性イオン性緩衝剤の存在によってネガティブな影響を受けることがわかった(Poole, Reilly, and Flint 1982)が、魚類細胞でも同じ影響があるかどうか、またあるとすればどの程度の濃度であるかは不明である。様々な緩衝剤の系統的なテストは、魚のESのような細胞のための理想的な培養条件を見つけるのに役立つかもしれない。

魚ES様細胞の無血清培養への影響

最適な増殖率とその最適な濃度を維持しながら、魚類 ES様細胞のために血清や他の動物由来の成分を置換することを可能にする要因の組み合わせは、現在のところ不明である。良い出発点は、陸生脊椎動物の細胞培養において血清の代替が可能であることが示されている成分を試験することであろう：セレン、トランスフェリン（潜在的には鉄濃度の調整と組み合わせて）、インスリン、および様々な成長因子。特にIGF2は、培地への添加により、従来の培地と比較して増殖率が低下するものの、メダカESCの無血清培養をサポートすることができるため、有力な候補である(Yuan and Hong 2017)。IGF2と合わせて他の成分を添加することで、動物由来成分を含まない魚類ES様細胞培養物の高い増殖率と持続性が期待できそうです。

非胚性魚類細胞用培地

一般的に、魚類からの非胚性細胞のために公表されている培地配合は、上述したものよりもやや単純であるが、それらもまた、一般的にはFBSを含み、同様に体系的な最適化の欠如に苦しんでいる。ニジマスと金目鯛の筋肉（おそらく筋細胞、ミオサテライト細胞、および他の細胞タイプの混合物を含む）からの初代培養は、15％の馬血清を含むDMEMを用いて開始され、その後10％のFBSで培養されている(Rescan et al. 1994; Montserrat et al. 2007; Castillo et al. 2002).。これらの条件下で、細胞は融合し、最終的には10日から15日の間に大きな筋管を形成した(Montserrat et al. 2007; Castillo et al. 2002)。ミナミナミマグロから単離された上皮様の形態を有する連続的な細胞株は、10〜20％のFBSを含むL-15中で8ヶ月間維持することに成功した(Bain et al. 2013)。10％未満のFBSの濃度は、増殖率の低下をもたらした。ヒトFGF2は、単離および初期の継代中に含まれていたが、それが生存または増殖に影響を及ぼすかどうかは評価されなかった。チャンネルナマズからの卵巣細胞の無血清培養は、培地中に存在する血清濃度を徐々に減少させることによって達成されている(Radošević et al. 2016)。この細胞タイプは、培養肉には関係ないと思われるが、無血清条件下に細胞を徐々に適応させる戦略は、他の細胞タイプにも適用可能であろう。

魚類におけるアミノ酸の必要量

陸生種におけるアミノ酸の必要量は、このシリーズのパートAで議論された。生体内では、ヒトと同じアミノ酸が、試験したほとんどの魚種で必須である(Wilson 2003) 。例外はアルギニンであり、これは魚の生体内では必須であるが、ヒトの細胞ではin vitroでのみ必須である。多くの魚種の定量的な食餌アミノ酸要件は、特定の魚種のために細胞培養培地を最適化しようとする研究者にとって有用なガイドとなるかもしれませんが、定量的なin vivoとin vitroの要件間の翻訳がどの程度直接的になるかは不明です。様々な地中海の魚種(Tibaldi and Kaushik 2005)とサケ科魚類(Lall and Anderson 2005)のアミノ酸の要件が詳細にレビューされている。どのアミノ酸が、もしあるとすれば、どの魚種において、in vitroでは必要とされるがin vivoでは必要とされないアミノ酸があるかは不明である。IGF2のみを補充したDMEMでのメダカESCの成功した成長(Yuan and Hong 2017)は、これは最適な濃度の違いの余地を残すが、in vitroの必須アミノ酸は、魚類と哺乳類の間で類似している可能性が高いことを示唆している。アミノ酸濃度は、胚性および非胚性魚類細胞株の両方のための培地の種特異的最適化において、特に培地のコストを最小限に抑えることが不可欠な場合に重要な因子である可能性がある。しかし、ほとんどの魚種から細胞を培養するために合理的にうまく機能する培地製剤を見つけるという目標を達成するためには必要ないかもしれない。

注目すべきことに、ゼブラフィッシュおよび他のいくつかの魚種は、イノシトール-３-リン酸合成酵素の遺伝子を欠いている。その結果、イノシトールは、哺乳類では非必須であるのに対し、ゼブラフィッシュの代謝モデルでは必須栄養素と考えられている(van Steijn et al. 2019)。ミオイノシトールは、コイ、ティラピア、およびオウム魚において最適な成長のための飼料要件として同定されている(Jiang et al. 2009; Khosravi et al. 2015; Shiau and Su 2005)が、後者の種のみがイノシトール-3-リン酸合成酵素遺伝子を欠いていることは注目に値するが。これらの様々な同族体の活性の正確な測定値がない場合、イノシトールレベルの最適化は、魚類用に最適化された基底培地を開発する上で重要なステップである可能性があり、この最適化は種ごとに行う必要があることを念頭に置く価値がある。

オスモラリティ

テレポスト魚類は、塩分を積極的に取り込む（淡水魚の場合）か、排泄する（海産魚の場合）ことで、細胞外液の浸透圧（図2）を300mOsm/kg程度のかなり狭い範囲に維持しています(Kültz 2015)。これはDMEMの310から360mOsm/kgの間のオスモラリティに近い。これと矛盾しないように、上記で引用した魚類細胞培養研究は、意図的に浸透圧を調整しておらず、淡水または汽水に限定されるナイルティラピア(Z. Fan et al. 2017)からの細胞を培養するために使用される培地は、海洋種からの細胞に使用される培地と同様の処方のものである。例外は、オスモコンフォーマー、すなわち細胞外液の浸透圧が環境の浸透圧と一致する魚類である。オスモコンフォーマーは水生脊椎動物の中では稀ですが、エラスモウミウシやハタハタなどが含まれています(Kültz 2015)。サメの胚からの間葉系幹細胞は、成体の軟骨魚の血漿よりも低い溶質濃度（この場合は浸透圧として表される）の培地で培養することに成功したが、これは、卵内の流体が周囲の海水よりも低い溶質濃度を含むという事実に関連している可能性がある観察である(Parton et al. 2007)。このように、オスモ適合種からの細胞の培養には、種と細胞株が由来したライフステージの両方に関連して、オスモラリティを明示的に考慮する必要があるかもしれません。

図2. 淡水魚(a)も海水魚(b)も、組織内で正しい浸透圧を得るためにイオン輸送を積極的に調節している。 Wikipedia.

甲殻類細胞培養用培地

一般的に、魚類と水棲甲殻類の間では、ほとんどのミネラルの生体内での必要量はかなり似ているが、いくつかの重要な違いがある(Davis and Gatlin 1996)。さらに、これらのグループ間の密接な進化の関係のために、昆虫細胞培養からいくつかの教訓を学ぶことが可能かもしれません。要件のための正確な値が報告されていないが、脊椎動物と同様に、セレンは、エビや潜在的に他の甲殻類によって必要と考えられている。鉄の調節された輸送と貯蔵のための証拠は甲殻類で観察されているが、エビの鉄欠乏の証拠は報告されていない。これは、甲殻類が主に酸素輸送のために鉄を含むヘモグロビンよりも銅を含むヘモシアニンに依存しているという事実と一致している。実際、ほとんどのマラコストラカン（エビとカニの両方を含むグループ）はヘモグロビンを完全に欠いている(Burmester 2015)。これと矛盾しないように、エビの食用銅の必要量は、種によっては魚のそれよりも6倍から35倍も高いかもしれない(Davis and Gatlin 1996)。甲殻類の低い鉄と高い銅の必要量が酸素輸送機構の違いだけを反映しているのか、あるいは培養条件下で個々の細胞の必要量が同じ傾向をたどるのかは不明である。鉄以外に、魚類の飼料に配合することが推奨されている唯一のミネラルは、ヨウ素とマンガンであるが、エビやロブスターには配合されていない(Davis and Gatlin 1996)。しかし、これらのミネラルは、一般的に細胞（魚類でも陸生動物でも）が必要とするものではなく、特定の臓器やシステムが適切に機能するためにのみ必要とされる可能性が高く、標準的なDMEM製剤には含まれていない。まとめると、鉄と銅は、魚類から甲殻類に培地製剤を適応させる際には、これらの生物での役割が大きく異なるため、特別な注意を払う必要があります。しかし、これらのミネラルが最も高く評価される役割である酸素輸送は、培養中と生体内では非常に異なった働きをするため、全生物の食事の必要性がどの程度単一細胞の必要性に反映されるかは不明である。

多くの試みは、いくつかの成功と、エビから細胞を培養することで行われているが、まだ連続的な細胞株は、まだ学術文献で報告されていない。しかし、初代細胞で行われた豊富な研究は、どのような培地配合が有望であるかについてのいくつかの洞察を提供している(Ma, Zeng, and Lu 2017)。一般的に、エビの細胞は様々な基底培地配合に適応しているように思われるが、どれが最も成功しているかは、問題の細胞タイプに依存しているように思われる。使用されたオスモラリティは、４７２〜７６０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲で、ＤＭＥＭよりも高かった。ＦＢＳは、一般的にエビ細胞の成長をサポートすることが見出されているが、最適な成長には十分ではないかもしれない。エビまたはその近縁種からの種々の抽出物は、しばしば有用であるが、必ずしも有用ではない。ＦＢＳとキトサンの両方が、エビの胚から開始された培養物の増殖をサポートし、ＦＧＦ２とＩＧＦ２の組み合わせは、増殖をさらに刺激した(T.-J. Fan and Wang 2002).。エビにおける細胞培養研究の広範なレビューは、他の場所で発表されており(Ma, Zeng, and Lu 2017),、基底培地の配合およびFBSおよび様々なエビ抽出物のようなサプリメントの両方についての議論を含む。エビ細胞株の確立において報告された課題にもかかわらず、2019年初頭にShiok Meatsによって実証されたエビ餃子は、培養食品を作成する目的でエビ細胞を培養することの実現可能性を指し示している。

カニ肝膵臓の初代細胞を人工海水で再構成した 3 倍濃縮 L-15 バッファー中で培養することに成功した (Sashikumar and Desai 2008).。これらの細胞の生存率は、FBSや様々なカニ抽出物の存在下で低下した。しかし、FBSのこれらの負の効果は、種に依存するというよりは、細胞のタイプに依存する可能性が高い。一次カニ血球は、アミノ酸-糖の補足および１５％ＦＢＳを含む２ｘ濃縮Ｌ-１５で良好に成長した(Sivakumar et al. 2019).。同様に、10％FBSを添加した2x L-15は、カニのアイストークニューロンの成長に成功したが、5％FBSは生存をサポートするのに不十分であることが判明した(Wajsenzon et al. 2016)。

結論

養殖魚介類を有望なアイデアから、現在の魚介類生産方法に関連する環境、倫理、および食糧安全保障の問題に経済的に実行可能な解決策へと移行させるためには、魚介類に関連する種で使用するための最適化された低コストで動物性成分を含まない培地配合物が切実に必要とされている。幸いなことに、魚介類の栄養ニーズや食肉用に飼育されている一般的な陸生種との生物学的な違いに関する豊富なデータがある。さらに、哺乳類細胞の最適化プロジェクトの成功例(Kuo et al. 2020) は、魚介類種で同様の目標を試みている者にロードマップを提供することができる。メダカESCの無血清培養は実証されている(Yuan and Hong 2017)が、コストを削減し、増殖率を高め、魚介類に関連する種に適応した製剤を見つけるためには、さらなる最適化が必要である。これらの研究には時間と努力が必要であるが、養殖魚介類の実現に必要な最適化された培地配合に向けた明確な道筋がある。細胞増殖の違いとは無関係に，養殖魚介類の栄養特性や有機物摂取特性に及ぼす培地組成の潜在的な影響については，魚介類と陸産肉の両方についてシリーズVで議論する予定である。